亲和层析实验方法-溴化氰活化

亲和层析的实验操作和一般柱层析类似，都包括：装柱、上样、洗脱、样品收集、结果处理等步骤。

溴化氰活化琼脂糖用于配体固相化是实验室亲和层析最常用的技术之一，该方法简便廉价，并广泛应用于蛋白质、核酸、凝集素等。下面以此为例介绍亲和层析的实验方法：

试剂与配制

1.Sepharose 4B

2.CNBr（剧毒）

3.抗原或抗体

4.1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

5.0.1Mol/L NaHCO3

6.2Mol/L NaOH

7.0.01Mol/L pH7.4 PBS 0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml ?0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml ??NaCl32.76g 加水至4 000ml。

3.8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl84ml加水166ml共500ml。

3.9．7Mol/L尿素

3.10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）1Mol/L NaHCO3 100.00ml NaCl?? 2.93g 加水至500.00ml。

琼脂糖活化

1.取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。

2.在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0～11.0维持10min。

3.将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。

4.偶联蛋白20ml 4B液体相当于一半的固相载体。事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。

5.将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内，从抽洗到偶联），4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。

6.在烧结玻璃漏斗中用200ml偶联缓冲液（0.1mol/L碳酸氢钠，0.5mol/L氯化钠，pH8.3）洗偶联介质一次。

7.转移偶联介质至含100ml阻断缓冲液（1mol/L乙醇胺，盐酸调pH至8.0）的烧瓶内，室温孵育2h或者4℃过夜。

8.在烧结漏斗中依次用100ml偶联缓冲液100乙酸盐缓冲液（0.1mol/L乙酸钠，0.5mol/L氯化钠，pH4.0）洗偶联介质一次，重复此步骤四次。

9.如果不准备立即使用偶联介质，影使用含0.02%叠氮钠的偶联缓冲液再洗一次。

装柱

1.选柱：不宜过大，一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。

2.装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。

3.洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止。收集全部的洗脱液，测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。

吸附与解吸附

1.按床体积1/10加样，浓度为1%～2%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280＜0.02为止。

2.加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。

以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。

结果判定

1.对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。

将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。