组织和细胞RNA的制备:异硫氰酸胍法
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(一)试剂准备
1. CSB缓冲液:42mM柠檬酸钠;0.83% N-lauryl sarcosine(十二烷基,N甲基甘氨酸钠);0.2 mM β-巯基乙醇。
2. 变性液:异硫氰酸胍(终浓度 4 M)25g、CSB缓冲液 33ml,混合直至完全溶解,可在65℃助溶。4℃保存备用。
3. 2 M乙酸钠:pH 4.0。
4. 异丙醇
5. 无水乙醇、70%乙醇
6. 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)
7. DEPC H2O:100ml ddH2O中,加入DEPC 0.1ml,弃分振荡,37℃孵育过夜。15磅高压灭茵,4℃保存备用。
(二)操作步骤
1. 样品处理:
(1)培养细胞:收集细胞1-2×107,离心,500g×5min。对于贴壁培养细胞,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后,PBS重悬细胞并转移至10ml离心管中;悬浮培养细胞可直接转移离心管;离心:500g×5min;PBS洗涤2次。弃上清,置冰浴。加预冷变性液2 ml,充分摇动,使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。
(2)组织:取1-2g组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置组织匀浆器中,加入预冷的变性液12ml,在冰浴中充分匀浆。
2. 加2 M乙酸钠(pH 4.0)0.2ml,混合后将溶液转移至5ml离心管中。
3. 加酚:氯仿:异戊醇2.2ml,颠倒混合用力振荡10s,冰上放置10min。
4. 4℃离心,12000g×20min。
5. 小心吸取上层含有RNA的水相,并转移至一新的5ml离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。
6. 加等体积的异丙醇,置-20℃至少30min,沉淀RNA。
7. 4℃离心,12000g×15min。
8. 弃上清,再加变性液2ml重悬RNA沉淀物,振荡直至RNA完全溶解(必要时可65℃水浴促溶)。
9. 加入等体积异丙醇,置-20℃ 30min。
10. 4℃离心,12000g×15min。
11. 弃上清,加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心,8000g×5min。
12. 弃上清,将沉淀晾干。
13. 加入适量DEPC H2O溶液解RNA(65℃促溶10-15min)。
(三)注意事项:
1. 所有实验过程均须避免Rnase的污染。
2. 要避免沉淀完全干燥,否则RNA难以溶解。