植物组织总RNA的制备:异硫氰酸胍—酚法
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异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下:GIT与β-巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性;GIT与 十二烷基肌氨酸钠 (Sarcosyl)作用使蛋白质变性,从而释放RNA;酸性条件下DNA极少发生解离,同蛋白质一起变性被离心下来,RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA,逆转录及构建cDNA文库,因此为大多数人采用。与氯化铯方法比较,虽然纯度稍差一些,小分子RNA,如tRNA、snRNA不易去除,但产量高完整性好,盐易去除。
一、材料、试剂和 仪器
1 材料 植物组织(根或叶)
2 试剂
1) 异硫氰酸胍溶液:4mol/L 异硫氰酸胍(GIT),25mmol/L柠檬酸钠(pH 7.0),0.5% 十二烷基肌氨酸钠 (Sarcosyl), 0.1M β-巯基乙醇 (用时再加,0.36mL/50mL体系)
2) 2mol/L NaAc (pH4.0):用醋酸配,加少量水调pH。
3) 水饱和酚 (pH3.5)
4) 氯仿/异戊醇(CI)(24:1)
5) 异丙醇 ( -20℃存放)
6) DEPC-H2O (0.1%,V/V)
3 仪器 : 冰冻离心机,研钵
二、实验程序
1 大量提取
1) 取植物组织5g加入液氮充分研磨,转到一支预冷50mL的 离心管 中,顺序加入:15mL 异硫氰酸胍溶液,1.5mL 2M NaAc(pH4.0),15mL水饱和酚和3mL氯仿/异戊醇。混匀后置冰上15min。
2) 4℃,15 000g 离心30min转上清于另一管中,加等体积异丙醇,混匀-20℃沉淀1hr.。
3) 4℃,15 000g 离心25min,弃去上清,加5mL 异硫氰酸胍溶液溶解沉淀后再加异丙醇—20℃沉 淀1hr。离心收集RNA沉淀,70%乙醇洗一次后晾干,加500μl DEPC处理的水溶RNA。取5μl电泳检测完整性,取5μl测紫外吸收值检测纯度及浓度。
2 小量提取
1) 取2g左右植物组织放入研钵中,反复加入液氮充分研磨至粉末状。加4-5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小 离心管 中,每管0.5mL。
2) 置于冰上,顺序加入:50μl 2mol/L NaAc , 混匀,0.5mL水饱和酚, 170μl CI,混匀。置冰上15min。
3) 各管平衡后,4℃,12 000g离心20-30min。转移上清到另一管中,加入等体积的异丙醇,混匀,-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。
4) 用70%乙醇洗一次,4℃,12 000g离心5min。吸去乙醇,空气中吹干RNA沉淀。用150μl 异硫氰酸胍溶液,65℃吹打RNA沉淀溶解。
5) 加等体积异丙醇-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。
6) 用70%乙醇洗两次后,吹干溶于适量的DEPC-H 2 O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于-80℃冰箱中存放。
7) 紫外分光光度分析纯度和含量,甲醛变性 琼脂 糖凝胶电泳分析完整性。
一、材料、试剂和 仪器
1 材料 植物组织(根或叶)
2 试剂
1) 异硫氰酸胍溶液:4mol/L 异硫氰酸胍(GIT),25mmol/L柠檬酸钠(pH 7.0),0.5% 十二烷基肌氨酸钠 (Sarcosyl), 0.1M β-巯基乙醇 (用时再加,0.36mL/50mL体系)
2) 2mol/L NaAc (pH4.0):用醋酸配,加少量水调pH。
3) 水饱和酚 (pH3.5)
4) 氯仿/异戊醇(CI)(24:1)
5) 异丙醇 ( -20℃存放)
6) DEPC-H2O (0.1%,V/V)
3 仪器 : 冰冻离心机,研钵
二、实验程序
1 大量提取
1) 取植物组织5g加入液氮充分研磨,转到一支预冷50mL的 离心管 中,顺序加入:15mL 异硫氰酸胍溶液,1.5mL 2M NaAc(pH4.0),15mL水饱和酚和3mL氯仿/异戊醇。混匀后置冰上15min。
2) 4℃,15 000g 离心30min转上清于另一管中,加等体积异丙醇,混匀-20℃沉淀1hr.。
3) 4℃,15 000g 离心25min,弃去上清,加5mL 异硫氰酸胍溶液溶解沉淀后再加异丙醇—20℃沉 淀1hr。离心收集RNA沉淀,70%乙醇洗一次后晾干,加500μl DEPC处理的水溶RNA。取5μl电泳检测完整性,取5μl测紫外吸收值检测纯度及浓度。
2 小量提取
1) 取2g左右植物组织放入研钵中,反复加入液氮充分研磨至粉末状。加4-5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小 离心管 中,每管0.5mL。
2) 置于冰上,顺序加入:50μl 2mol/L NaAc , 混匀,0.5mL水饱和酚, 170μl CI,混匀。置冰上15min。
3) 各管平衡后,4℃,12 000g离心20-30min。转移上清到另一管中,加入等体积的异丙醇,混匀,-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。
4) 用70%乙醇洗一次,4℃,12 000g离心5min。吸去乙醇,空气中吹干RNA沉淀。用150μl 异硫氰酸胍溶液,65℃吹打RNA沉淀溶解。
5) 加等体积异丙醇-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。
6) 用70%乙醇洗两次后,吹干溶于适量的DEPC-H 2 O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于-80℃冰箱中存放。
7) 紫外分光光度分析纯度和含量,甲醛变性 琼脂 糖凝胶电泳分析完整性。