正常人乳腺上皮细胞培养

实验材料：

1. 人哺乳期早期或断奶后乳汁。

2. 培养液：RPMI1640，15%FBS，10%人血清，50μg/ml霍乱毒素，0.5mg/ml氢化可的松，1mg/ml胰岛素。

3. HuS（human serum）：血库过期的血清，澳大利亚抗原阴性。5cm Nunc塑料培养皿。

4. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素，pH7.4。

5. 培养用液：1mg/ml胰岛素（Sigma）：用6mmol/L盐酸配制；0.5mg/ml氢化可的松：用生理盐水配制；50μg/ml霍乱毒素（Schwartz-Mann）：用生理盐水配制。

P.S：血清和储存备用的胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、胰酶和胰蛋白酶应在-20℃条件下保存。

6. 消化液（TEGPED）：胰蛋白酶液：加入13mmol/L EGTA 10ml，用PBSA配置。

7. 7 mmol/L EDTA：4ml，用PBSA配置。

8. 0.2%胰蛋白酶（Difco）：4ml，用HBSS配置。

9. 1%胰酶：2ml，用HBSS配置。

实验方法：

1. 于产后2-7d收集乳汁。用无菌水擦洗乳房，将乳汁挤入无菌容器。将收集的乳汁混合后，用RPMI1640稀释，以利于离心。

2. 将稀释的乳汁离心（600-1000g，20min）后，轻轻吸去上清。为了避免影响沉淀细胞，应留有少量液体。用含有5%FBS的RPMI1640洗细胞2-4次，直至上清不浑浊。

3. 用生长培养液混悬细胞，将50μl细胞悬液加入含6ml培养液的5cm培养皿中。在37℃，5%CO2 条件下培养细胞。

4. 3-5d后换液，以后每周换液2次，6-8d出现克隆。开始时，有巨噬细胞混杂生长，起着饲养细胞的作用。克隆增多后巨噬细胞逐渐消失。

5. 传代培养。细胞长满底壁80%-85%时，可传代。每个5cm培养皿1.5ml加入TEGPED，在37℃条件下用，孵育细胞5-15min。然后，混悬细胞。

6. 离心（100g，5min）后，用培养液混悬细胞，将细胞悬液稀释3倍。将细胞悬液接种到培养皿或培养瓶中，每3个培养皿或每1个培养瓶2ml。