小鼠乳腺上皮细胞培养

PriCells: 小鼠乳腺上皮细胞培养

实验材料：

1. 10-12周龄妊娠小鼠乳腺组织

2. 不含Ca 2+ 和Mg 2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素，pH7.4

3. FBS、含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS液或DMEM

4. 0.05%Ⅰ型胶原酶50ml、0.05%蛋白酶50ml、0.1%DNaseⅠ型、结晶紫（0.1%）/枸橼酸（0.1mol/L）

5. 培养液：血清培养液（DMEM或F12+10%FBS）、无血清培养基（DMEM:F12为1：1，加胰岛素1-5μg/ml、转铁蛋白10μg/ml、BSA1-5mg/ml等）。胶原凝胶铺底液（酸性胶原液或自制鼠尾胶原，10×F12，用缓冲液稀释）

6. 分化培养基：为DMEM/F12按1：1（体积比）比例配制的混合培养基，添加5μg/ml胰岛素、1μg/ml氢化可的松、3μg/ml催乳素和50μg/ml庆大霉素。其中，催乳素以3μg/ml浓度溶于10mmol/L NaOH中，过滤除菌，4℃下可保存2周，使用前添加到培养基中。

7. C中性蛋白酶溶液：为9.6μg/ml的Dispase溶液，用DMEM配制。

8. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊

9. 离心管（15ml、50ml）、10cm塑料培养皿、300ml有盖的三角烧瓶（2个，处理胶原酶及蛋白酶用）、高压灭菌的带尼龙网（孔径150μm）的烧杯

10. 厚胶原胶的制备：以8：1：1（体积比）的比例配制鼠尾胶原、F12与NaHCO 3 /NaOH的混合液作为包被液。包被液的组分包括鼠尾胶原液、10×浓度的F12、0.26mol/L NaHCO 3 和0.125 mol/L NaOH混合液。分别除菌。将包被液和培养板在4℃下预冷。然后，按150μl/cm 2 的用量加到培养器皿内。置37℃下1h，用培养液洗2次（每次30min），然后加入血清-胎球蛋白混合液。

实验方法：

1. 麻醉处死小鼠，75%乙醇消毒，置于蜡板上，用大头钉固定四肢。用正中线剪开皮肤，用镊子引开皮肤，用大头针固定在板上。切下约5g乳腺脂肪组织，放入装有PBS液的平皿内洗涤3次。

2. 用刀片反复切割、或用剪刀剪碎乳腺至糊状。然后将组织碎块移至三角烧瓶内，加50ml胶原酶，置37℃恒温水浴中水平振荡1-2h（100-200次/min）。

3. 当无大片组织块时，用尼龙网将细胞滤至烧杯内，以除去未消化的组织。滤液移至5ml离心管内，1000r/min离心约3min，去上清，加PBS液2ml在手中振摇使细胞团大散，移入装有50ml胶原酶的三角烧瓶内，这时会见部分细胞悬液中出现云雾状，经10-15min后会消失。放入37℃恒温水浴中缓慢水平振摇30min（30次/min）。

4. 加10%血清或BSA约5ml，同上法用尼龙网过滤，以1000r/min离心约1min。向细胞团中直接加血清或BSA约1ml，拍击离心管，打散细胞团（此时细胞脆弱，一般不进行吹打）。移至10ml离心管中，加5mlPBS液混匀，以1000r/min离心约1min，洗涤细胞3次，可除去成纤维细胞和红细胞。

5. 最后向细胞团中加血清或BSA，打散细胞团，加5-10mlPBS液吹打10次左右，使其成为均一的细胞悬液，计数细胞数。用此法分离的细胞多呈块状，很难正确计数，必要时用0.1ml细胞悬液加0.9ml结晶紫，剧烈振摇细胞约1min，此时细胞易破坏而使胞核着色，可计数蓝染细胞核数。每克组织约可收货5×10 6 —10×10 6 个细胞。

6. 得到的细胞用含10%FBS的DMEM或无血清培养液悬浮，将上述消化的乳腺上皮细胞以密度为1.0×10 5 —2.5×10 5 个/cm 2 将其接种在厚胶原胶膜包被的培养板上，加入细胞分化培养基进行培养。

7. 培养72h，待细胞融合后，用移液器吸头或细胞刮刷将胶原膜与培养板底面分离，使胶原膜收缩并漂浮在培养基中，之后每2-3d更换一次培养液。

8. 细胞传代。消化溶液为10×胰蛋白酶-EDTA混合消化液，在37℃下孵育7min。另外，使用中性蛋白酶溶液作为消化液。操作如下：原代细胞培养后，用DMEM培养基洗培养板，再用1/4稀释液（2.4μg/ml）的中性蛋白液洗培养板2次。加入100μl/cm 2 的Dispase溶液，于37℃静置20min。再加入5%胎牛血清的DMEM/F12培养液以终止消化。

9. 再用含5%胎牛血清的DMEM/F12离心洗涤沉淀细胞（250r/min，4min）。离心后用5%胎牛血清的DMEM/F12培养液重新悬浮细胞。

10. 将细胞悬液以1.0×10 5 —2.5×10 5 个/cm 2 的细胞密度接种，培养在生长培养基中。如果用于分化培养，接种24-48h后可更换为分化培养基。

11. PriCells-原代上皮细胞特制基础培养基

12. PriCells-原代上皮细胞培养特制添加剂

13. PriCells-原代细胞分离试剂盒

14. PriCells-原代细胞 鉴定 试剂盒