新型的基因分型技术(SNP分型)：巢式PCR-RFLP技术

随着生命科学迅猛的发展，与之相适应的实验技术手段越来越复杂和专业化，对于科研人员实验技能要求也越来越高。由于生物学实验高度的复杂性、使得一个科研人员往往只能精通某一方向的实验。因此许多生物技术公司应孕而生，他们提供了许多专业的服务，其中最常规的技术服务包括核酸、蛋白测序、引物合成，SNP分型，动物培养及转基因动物实验。

在国外，生命科学的研究已经初步形成了一个大型技术平台共享的研究形式，科研人员的主要工作是进行实验方案的设计、若干实验和实验数据的分析工作，而大量的基础性的实验工作则由相应的技术公司来完成，据不完全统计，2004年全美60%的SNP分型工作就是外包的生物技术公司完成。因为专业的技术公司在各自领域有着雄厚的技术背景和丰富的实验经验，试验成功率更高,实验数据也更可靠，这样科研人员也能够将主要精力放在真正的科研－实验设计和数据分析中去。

出具有针对性的SNP分型技术，“巢式PCR-RFLP”基因分型技术，不同于传统的只能对于有酶切位点的传统的SNP分型的技术，本公司开发的“巢式PCR-RFLP是针对任意的基因分型技术，使任何位点最终都能进行常规限制性内切酶鉴定；同时该SNP分型技术利用巢式PCR技术，使得多个位点同时进行分析称为可能。即使低浓度的DNA也能够进行快速准确的分型工作。 与现有常规的分型技术相比，其最大的优势包括：

（1）所需DNA浓度低。1-2 ng/uL 也能完成检测工作，而Taqman技术所需的DNA含量至少5 ng/uL。

（2）价格低。由于不需要合成荧光探针，使得该技术比Taqman技术价格低，该优势在对多个位点同时进行分型时更明显。

与Taqman技术和普通技术的详细对比

分型技术 PCR-RFLP技术 Taqman技术 普通PCR-RFLP技术

最佳运用时机 200-600样本，任何DNA多态位点 样本量大于500人份 仅适合含有现成酶切位点的多态位点的分型

试剂投入低荧光探针，需3000-4000元。有可能实验失败需重新花钱设计荧光探针。 低技术的适用性可适合任何多态位点的分型基本适合任何多态位点的分型，但有时若干位点不能成功进行试验；当分型位点过于接近也不能用该方法。仅适合含有现成酶切位点的多态位点的分型，有时出现的是一些稀有酶的酶切位点，导致效率低下或费用昂贵；

结果判断直观，明确，稳定间接，每管反应必须加荧光参照ROX，否则结果判断不确定 一般直观，明确；有时酶切位点出现在非主频等位基因上，导致结果判读困难结果稳定性 稳定 一般 稳定结果准确性 准确度高 一般准确度高样本消耗量1-2ng，5-10ng，50－100ng，实验耗时 2-3周 由于要定制MGB荧光探针，和预实验，也需要2-3周 2-3周。

操作流程　

1．基本信息收集具体内容包括客户信息、样本数(case,control)数、位点信息等。　

2.　位点信息的查询 主要包括：2.1 位点上下游各300bp的确切序列，基因频度;2.2 有无文献报道证明该位点多态存在于中国人群;2.3 如无上述相关文献,在J-SNP数据库中查询该位点多态是否存在于东亚人群中。为了保证结果的可靠，实验方案设计原则上应以野生型进行酶切鉴定，因此确认snp的频度是非常重要的。　

3．样品质控从全部样品中取8%样品，即96个样品中取8个样品，用我们的一对特异的PCR引物进行样品质控，以检测送来样品是否良好。因为客户样品质量是实验成功的关键因素之一，只有客户提供的样品质量可靠稳定，那么结果自然就好。
　
4．引物设计同时设计AB两套方案，分别以正链和负链为模板设计引物。
　
5．单管测试进行实验方案可行性尝试，首先要在多种温度，多种Mg离子、多种添加剂加入的情况下进行方案的可行性测试，对于所有单管测试的结果都送去测序，以保证序列的正确性，在实验结果得到确认的基础上，挑选稳定的方案进入中试过程。　

6．中试抽取8个样品做小规模批量实验，以模拟和检查批量PCR情况和酶切情况。　

7．大规模实验准备将DNA模板按方案进行一次性分板(有冗余)，并引入阳性和阴性对照，同时将所有相关的PCR体系进行一次性大规模分装，防止污染。　

8．第一板数据先用一板模板进行一轮PCR和酶切，以检验体系和分板的情况。　

正式实验相关技术要点　

1）实验设计必需保证野生型的被限制性内切酶切开因为对于只有少量突变型的SNP位点，如果突变型被切开，那么所得到的实验结果就是大量没有被酶切开的PCR产物，而这个结果与酶切实验失败的结果非常类似，不易区分，对结果的判读造成很大的麻烦，因此保证了主频碱基被解开，从根本上保证了实验的可靠性。　

2）偏向性扩增的解决。所谓偏向性扩增是因为SNP位点上会往往存在嘌吟和嘧啶的替换，在PCR过程中，聚合反应对嘧啶(C或T)比较敏感，使得嘌吟(A或T)的扩增非常少，而出现偏向性扩增，这在SNP位点附近嘌吟含量较高时特别明显。为此，本公司专门设计一个方案，用以克服偏向性扩增。　

3）方案设计中的内切酶的选择虽然从理论上，我们的方案可以进行任意位点改造，但事实上在改造过程中会出现一系列的问题，包括扩增效率，碱基划移等一系列问题，使得改造方案失败。对此，我们公司专业开发了一个引物设计软件，通过运算获得最佳的改造方案，同时通过在正向和反向序列上同时设计方案，以保证试验的成功。　

4）PCR产物的污染问题在大规模的PCR过程中，最严重的问题是PCR产物污染，据我们经验总结，80％以上的污染是由于接触式污染，剩余的污染则包括气溶胶污染等环境造成的污染。对于PCR污染这个问题，本公司制订了严格的实验措施，具体包括使用滤芯抢头、所有PCR体系全部分装、PCR体系与各类模板严格分离、配置体系人员与接触PCR产物人员严格分离等一系列措施，同时在处理PCR管，eppendorf管时也规定了详细的操作过程。　

5）关于质量控制问题在每板PCR过程中，我们会放入两个阴性对照和一个重复对照，以确认PCR的过程中不会产生污染和PCR的结果确实可信。 技术基本原理和实例本公司采用的巢式PCR－RFLP分型技术，其基本原来是利用PCR引物的3’端，对SNP位点附近的碱基进行人为改造，产生一个常规的限制性内切酶识别序列，如SNP rs1321425（rs1321425－来自NCBI的refSNP数据库）的C/G，其任何一个碱基和上下游碱基无法形成一个可直接被限制性内切酶识别的序列，于是我们对SNP位点前的上游碱基进行改造，通过对序列的分析和PCR效果的计算，我们将原本四个碱基AGAT改成CTGC，结合后一个碱基A以及SNP位点G，形成CTGCAG（PstI）酶切识别位点，经测序和序列对比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的将2个碱基，3个碱基进行成功的改造．

rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATA C/G ACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCAC TTCTGTAAACTACATGCACTAAT rs9309462CTCGGGCCGCGAGTCCAATTTATACAAAAA C/T GTTGTATTTTTAGCCCTGGGCTCTGTTTAGATGGCG CTCGGTGGAAACGG 　 rs4646642　GGGGCAGATGTTTGGGCCGGGAACAATTTTC/T CAAGGTTGTAAAGCCAAATTATCATTTCATGTTATCCATTTCTTCAAAGC

本改造方案的成功之处在与3’端碱基的改造，一般而言，如果PCR引物的近3’端的几个碱基不能与模板互补，其实验是不能成功的，事实也大致如此。但本公司所采用的方案确能成功的将3’端引物进行改造，即使是3’端最后一个碱基与模板不匹配，我们也能成功的进行改造。如SNP（rs10491482），在改造过程中，与SNP直接相邻的GAA被改成了TGC，形成了GTGCAC(ApaLI)，就有3’端最后一个碱基被成功改造，形成限制性内切酶识别序列．

rs10491482AGGCAGCCATGGACAATTTGCCTTTTTATTCTACTTGGAA A/G CTCTGCTGATAAAGCTGTTT AAGGGGCTCAGGTGCTGACAGGCTGGGCACTGTCAGTATC 　这里所展示的实例，往往改造2、3、4个碱基，事实上，本方案理论上可进行5个碱基的改造，从而人为构建一个识别位点，但从碱基的组合而言，需要改动如此多的碱基很少，而且PCR效率也不是很高，因此若非有特殊需要，一般不产生5个碱基的改动。