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PCR-RFLP HLA分型技术

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PCR-RFLP HLA 分型技术
限制性核酸内切酶的识别位点具有严格的DNA序列特异性,不同型别HLA抗原的编码基因在DNA序列上存在差异,用一组限制性核酸内切酶对经PCR扩增后的HLA基因片段进行酶切,由于在不同HLA等位基因上限制性酶切位点的分布存在差异,酶切后的PCR产物经凝胶电泳后就会显示不同的电泳带型,借以鉴定HLA基因的型别。图10-2是采用PCR-RFLP技术进行HLA-DRB1等位基因型别鉴定的示意图。
PCR-RFLP原理示意图
PCR-RFLP方法有以下优点:(1)PCR-RFLP方法远较PCR-SSO方法(指一般的PCR-SSO方法,而不是PCR-反相SSO方法)简单和实用,因为PCR-RFLP不需要制备和标记众多的SSO探针;(2)在鉴定单个碱基差异方面,PCR-RFLP方法可能比PCR-SSO方法更为简便和准确,因为PCR-RFLP方法无须繁琐地调整杂交和洗膜的条件;(3)PCR-RFLP显示二个酶切位点之间的长度,这种信息有利于鉴定某些不能用PCR-SSO方法区分的杂合子,例如用PCR-SSO技术进行HLA分型时,HLA-DRBundefined 0403/0408、HLA-DRBundefined0404/0407 杂合子的杂交格局是相同的,而PCR-RFLP技术采用SacII + HpHI双酶切就可以显示出显然不同的酶切片段,从而鉴定出杂合子;(4)在样本数目较少的情况下,PCR-RFLP方法的费用低。
由于PCR-RFLP分型技术是基于限制性核酸内切酶识别位点的特异性,而限制性核酸内切酶并不能识别所有的碱基变化,所以PCR-RFLP技术尚不能检出所有的HLA等位基因。
【试剂配制和仪器要求】
1 、主要试剂
(1) 相应HLA基因引物
(2) dTTP,dCTP,dGTP
(3) Taq多聚酶
(4) 相应的限制性核酸内切酶
(5) 琼脂糖凝胶电泳试剂和材料
(6) 聚丙烯酰胺电泳凝胶电泳试剂和材料
(7) DNA提取试剂
2 、主要设备
(1) 可调加样器(1~10ul,10~100ul,100~1000ul)
(2) PCR扩增仪
(3) 聚丙烯酰胺电泳凝胶电泳装置
(4) 电泳凝胶观察系统或电泳凝胶图象分析系统
(5) 涡旋震荡器
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