PCR-RFLP HLA分型技术
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PCR-RFLP HLA 分型技术
限制性核酸内切酶的识别位点具有严格的DNA序列特异性，不同型别HLA抗原的编码基因在DNA序列上存在差异，用一组限制性核酸内切酶对经PCR扩增后的HLA基因片段进行酶切，由于在不同HLA等位基因上限制性酶切位点的分布存在差异，酶切后的PCR产物经凝胶电泳后就会显示不同的电泳带型，借以鉴定HLA基因的型别。图10-2是采用PCR-RFLP技术进行HLA-DRB1等位基因型别鉴定的示意图。
PCR-RFLP原理示意图
PCR-RFLP方法有以下优点：（1）PCR-RFLP方法远较PCR-SSO方法（指一般的PCR-SSO方法，而不是PCR-反相SSO方法）简单和实用，因为PCR-RFLP不需要制备和标记众多的SSO探针；（2）在鉴定单个碱基差异方面，PCR-RFLP方法可能比PCR-SSO方法更为简便和准确，因为PCR-RFLP方法无须繁琐地调整杂交和洗膜的条件；（3）PCR-RFLP显示二个酶切位点之间的长度，这种信息有利于鉴定某些不能用PCR-SSO方法区分的杂合子，例如用PCR-SSO技术进行HLA分型时，HLA-DRBundefined 0403/0408、HLA-DRBundefined0404/0407 杂合子的杂交格局是相同的，而PCR-RFLP技术采用SacII + HpHI双酶切就可以显示出显然不同的酶切片段，从而鉴定出杂合子；（4）在样本数目较少的情况下，PCR-RFLP方法的费用低。
由于PCR-RFLP分型技术是基于限制性核酸内切酶识别位点的特异性，而限制性核酸内切酶并不能识别所有的碱基变化，所以PCR-RFLP技术尚不能检出所有的HLA等位基因。
【试剂配制和仪器要求】
1 、主要试剂
（1） 相应HLA基因引物
（2） dTTP，dCTP，dGTP
（3） Taq多聚酶
（4） 相应的限制性核酸内切酶
（5） 琼脂糖凝胶电泳试剂和材料
（6） 聚丙烯酰胺电泳凝胶电泳试剂和材料
（7） DNA提取试剂
2 、主要设备
（1） 可调加样器（1～10ul，10～100ul，100～1000ul）
（2） PCR扩增仪
（3） 聚丙烯酰胺电泳凝胶电泳装置
（4） 电泳凝胶观察系统或电泳凝胶图象分析系统
（5） 涡旋震荡器
