细胞凋亡

细胞程序性死亡是正常生理现象，多发生于胚胎发育和维持组织自身平衡。Kerr et al.最早发现有两种细胞死亡：坏死（Necrosis）和凋亡（Apoptosis）。

Apoptosis，希腊文意思是树叶从树上“凋落”，这里是指凋亡，是细胞主动参与自身死亡的过程。凋亡程序有一些特殊形态学特征，包括质膜的改变，如细胞膜不对称性和细胞附着消失，胞浆和细胞核固缩，核内DNA裂解。到了晚期，凋亡细胞断裂成“凋亡小体”，并很快被巨噬细胞清除，而不会引起周围细胞的炎症损伤。坏死，通常是由细胞损伤或细胞毒物作用引起，在形态学和细胞生物特性上，与凋亡有着本质的区别。

坏死细胞的早期变化是细胞和线粒体肿胀，继而细胞膜破坏。不同于凋亡的是，坏死的细胞胞质内容物（多为蛋白水解酶）释放，会引起周围组织的炎症反应。病理情况会引起细胞异常凋亡，如Alzheimer氏综合症、Hodgkin氏综合症、移植物抗宿主性疾病、移植排斥、自身免疫性疾病、肿瘤、AIDS等。

随着对凋亡机制的深入了解，越来越多的凋亡检测方法得到了发展和应用，应根据细胞或组织类型、凋亡诱导途径的不同，选择最佳的实验方法。凋亡最早的特征变化之一就是出现了一系列蛋白水解酶——Caspase酶。活化的Caspase酶裂解许多细胞内酶，引发凋亡细胞的特征性形态改变，这一过程的核心是Caspase-3的活化。另一个凋亡早期的变化是细胞膜对称性消失，包括质膜内侧的磷脂酰丝氨酸重新分布，由胞膜内侧翻转到胞膜外侧，而细胞膜的这种改变可以通过一种与带负电荷的磷脂高度亲和的蛋白——Annexin V来检测。

凋亡晚期，另一个特征变化是核酸内切酶活化，将DNA断裂降解，使用凝胶电泳的方法，可以观察到DNA断裂片段形成的“ladder”现象。这种凋亡细胞的DNA断裂碎片，也可以通过在DNA片段末端掺入荧光标记物的方法，在流式细胞仪上进行检测此种凋亡改变，如APO-BRDU、APO-DIRECT试验就是这种方法。近年来，还发展了RiboQuant RNase Protection Assay，可以对许多凋亡相关基因进行详细的分析，将凋亡过程的研究带入了mRNA水平。

细胞凋亡检测的常用手段主要分为形态学检查、分子生物学方法、免疫电泳法和细胞学检查。其中，用流式细胞术研究细胞凋亡在技术和应用领域方面应用日益广泛。由于可以对凋亡的多种特征进行快速、灵敏、特异的定性分析和定量分析，流式细胞术已经成为凋亡分析的重要检测手段。

PharMingen公司提供了许多从多种角度研究凋亡的试剂系统，包括小鼠、大鼠和人类蛋白抗体：Fas和Fas配体、TRAIL和DR3/DR4、Bcl-2家族、Caspase酶家族及其它信号蛋白；再有，提供了多种流式细胞仪检测试剂盒，包括：Caspase-3 Assay Kit、APO-BRDU和APO-DIRECT Kit、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit；另外，还提供了mRNA分析试剂——RiboQuant Rnase Protection Assay系统，为小鼠、大鼠和人类的凋亡相关基因分析提供了多探针模板。

死亡信号的受体和配体

Fas配体（FasL）和TRAIL（Apo-2L）属于介导宿主防御和免疫反应的TNF超级家族。FasL和受体Fas结合，或TRAIL和受体结合，可以引发信号传导途径，引起细胞凋亡。Fas/FasL系统在T细胞发育，消除自反应T细胞克隆，以及其他的负选择时，发挥了作用；而TRAIL介导途径主要影响转录因子、NF-kB及Caspase家族半胱氨酸水解酶的活化。另外，还发现一些TRAIL受体即可以激活TRAIL信号途径，如DR3、DR4、DR5，也可以充当“诱骗”受体，即所谓的DcRs，如DcR1、DcR2。

Caspase酶

尽管有许多信号可以诱导细胞程序死亡，但它们有一些共同的特征，其中之一是凋亡时一系列细胞内蛋白水解酶——Caspase酶的活化。Caspase酶具有催化活性，“C”代表具有半胱氨酸水解酶功能，“aspase”代表具有切断天冬氨酸末端的功能。在对哺乳动物同源基因ced-3（线虫C. Elegans的细胞死亡基因）的研究中，首次发现了具有半胱氨酸水解酶活性的Caspase酶家族。第一个发现的哺乳动物Caspase酶是ICE（Interleukin-1b Converting Enzyme），即caspase-1。随后又发现了一系列Caspase酶，包括：Caspase-1（ICE）、Caspase-2（ICH-1，Nedd-2）、Caspase-3（CPP32，Yama，apopain）、Caspase-4（TX，ICH-2，ICErel-II）、Caspase-5（ICErel-III，TY）、Caspase-6（Mch-2）、Caspase-7（Mch-3，ICE-LAP3，CMH-1）、Caspase-8（MACH，FLICE，Mch-5）、

Caspase-9（Apaf-3，ICE-LAP6，Mch-6）、caspase-10（Mch-4）、Caspase-13（ERICE）和Caspase-14（MICE）。按照序列同源性，Caspase酶可分为三种亚群：ICE类酶Caspase-1亚群（Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11和Caspase-12），ced-3类酶Caspase-3亚群（Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10）和Caspase-2亚群（至今为止，只发现了Caspase-2）。Caspase酶由无活性的“原酶” （~30-55kD）水解活化而来：细胞发生凋亡时，原酶发生自身水解反应或由其他蛋白裂解，形成大亚单位（17-20kD）和小亚单位（10-12kD），二者组合，形成活化的Caspase酶。这些蛋白水解酶的大亚单位还含有小到六个氨基酸，大到几个kD不等的前区。因此，大亚单位的分子量可以很大，如活化的Caspase-1为35kD。水解后活化的Caspase酶的功能是对许多胞浆内和核内目标，如PARP、D4-GDI、DFF、MEKK等，进行裂解、活化处理。

在凋亡早期，活化的Caspase-3是主要的功能蛋白酶。凋亡细胞内，32kD的原酶裂解为17kD和12kD的亚单位，两个亚单位组成二聚体，即活化的Caspase-3，活化的Caspase-3进一步水解活化其它Caspase酶及胞浆内目标（如D4-GDI）和核内目标（如PARP）。

Bcl-2家族

Bcl-2家族在控制凋亡信号引起的细胞反应中，起了重要作用。Bcl-2在很多细胞中可以阻断凋亡，引发肿瘤，因而被认为是一种原癌基因。Bcl-XL、Mcl-1和A1是凋亡的抑制剂，但另一些，如Bad、Bak、Bax和Bcl-XS，可以引起细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白间的相互作用可能有很重要的功能作用。例如，Bax可以形成二聚体或与Bcl-2和Bcl-XL形成异二聚体。Bax二聚体可以引发细胞死亡，而Bax异二聚体可以阻止细胞死亡。Bad是一个前凋亡信号，只能与Bcl-2和Bcl-XL形成异二聚体。Bad与Bcl-XL形成异二聚体后，Bad可以替换Bax- Bcl-XL二聚体中的Bax单位，进而促进细胞死亡。在体外，发现Bcl-2家族可能还对离子通道有影响。

Annexin V检测凋亡细胞的质膜变化

细胞发生凋亡时会有一系列的形态学特征性改变，其中，质膜的改变是早期凋亡的特征之一。细胞发生凋亡时，胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从胞膜内侧翻转到外侧，暴露于细胞外表面。Annexin V是一个35-36kD的Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，它与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可以与细胞外暴露的磷脂酰丝氨酸结合。Annexin V标记上FITC、PE或生物素，可以在流式细胞仪上灵敏地检测凋亡细胞。

DNA断裂碎片

细胞凋亡晚期的改变之一是DNA断裂降解：首先是调亡程序启动核酸内切酶活化，核酸降解，最终形成200bp左右的DNA片段。常用的一种检测DNA断裂碎片的方法是外源性TdT酶催化反应，即所谓的“End-Labling”或“TUNEL”染色。

凋亡相关蛋白——Tumer Suppressors

肿瘤抑制基因的生理功能是调控细胞繁殖。许多肿瘤抑制因子参与细胞间信号传递系统，使细胞从其周围获得并处理生长/抑制信号。如果一个细胞中，某一个关键信号表达缺失，这个细胞就会对生长/抑制信号失去反应性，继续进行细胞增殖。这种由于肿瘤抑制基因的正常功能表达缺失导致的细胞生长失控，会导致细胞增殖失控和肿瘤形成。

P53是一个53kD的核内磷蛋白，是一种肿瘤抑制蛋白，在细胞DNA发生破坏时，可以抑制细胞增殖。在人类肿瘤中，常发现伴有P53基因的突变：大肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胆囊癌等常发生P53基因错意突变。突变的P53在许多癌变细胞内有过渡表达，野生型P53可以与一些病毒性癌基因（包括SV40 large T、腺病毒的E1B、人类乳头状病毒的E6等）结合，形成特异性的复合物。当DNA损伤发生在细胞周期中的G1/S期时，野生型P53是重要的Checkpoint Protein。但是，目前仍不清楚点突变型的P53是否只是无意突变，或有功能改变。

视网膜母细胞瘤基因（Retinoblastoma Gene，Rb）编码蛋白是一种核内磷蛋白，它在脊椎动物的大部分正常细胞中均有表达，具有肿瘤抑制功能。在静止或分化完全的细胞中，Rb常以缺乏磷酸化的形式存在；而在增殖细胞中，Rb则常以过磷酸化的形式存在。缺乏磷酸化形式的Rb可以与一些病毒性癌基因（包括SV40 large T和腺病毒的E1A、HPV-E7）结合，这种结合作用可能造成这些病毒致癌蛋白的变形活化。另外，Rb也可以与一些Cyclin（如CyclinA、D、E以及E2F）相互作用。因此，Rb在控制细胞分裂繁殖方面，起了很重要的作用。

细胞凋亡

凋亡（apoptosis）, 程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）

生理性细胞死亡。

第一节    细胞凋亡概论

一、凋亡与坏死apoptosis vs. necrosis）

凋亡是一个受细胞主动调节的自身消化过程，凋亡细胞的特征形态学改变使其可被其它细胞吞噬而不泄露胞质内容物，不会引起炎症反应。

坏死是由于物理损伤、缺血或细菌毒素等引起的破坏性细胞死亡过程，细胞内容物的释放导致局部炎症反应。

二、凋亡的生理功能

1、维持组织稳态平衡（homeostasis）,通过干细胞分裂产生新细胞的同时，选择性地除去那些损伤的或老的或多余的细胞。

2、清除不需要的免疫细胞。

3、神经元发育

4、个体发育

三、凋亡细胞的形态学和生化特征

1、细胞皱缩（shrinkage）

2、质膜出泡（blebbing）

3、染色质浓缩

4、DNA裂解：核小体DNA ladder

5、磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧

6、凋亡小体的释放

第二节   凋亡的分子机制

一、细胞表面死亡受体

细胞死亡受体家族的成员是一类跨膜蛋白，它们均含有一个与配基结合的胞外结构域；一个跨膜域和一个转导胞外信号进入胞内的胞内结构域(死亡结构域)。这此受体（如Fas、TNF受体）同它们的配基结合后被激活并导致细胞凋亡。

二、Bcl-2家族

对B细胞淋巴瘤的研究发现bcl-2是一种抗凋亡基因，进一步研究证明它与ced-9基因同源。

1、由于8：14染色体易位所致的bcl-2过度表达抑制肿瘤细胞凋亡。

2、与Bcl-2功能相似的有Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, and A1等，构成一个大的蛋白家族。

3、这些蛋白表达于线粒体、内质网和核被膜的外膜，Bcl-2及其高度同源物Bcl-xl 保护线粒体膜的完整性。

Bax-促进凋亡的Bcl-2家族成员：

1、与Bcl-2结合的蛋白，包括Bax、Bak、Bik 、Bid、 Bim和HRK。

2、当在细胞中过度表达时促进凋亡，其杀细胞活性可被Bcl-2类蛋白拮抗。

3、抗凋亡蛋白和促进凋亡的蛋白如Bcl-2和Bax间的比率决定细胞对凋亡信号的敏感性。

4、Bax可被 P53上调，这是DNA损伤时P53诱导细胞死亡的一种方式。

5、这些蛋白通常存在于其它胞内隔室如胞浆中，在凋亡时移动进入线粒体。

三、Caspase 蛋白酶-实施凋亡的蛋白酶

1、这是一族半胱氨酸（cysteine）催化的在天冬氨酸（aspartic acid）处裂解底物的蛋白酶（半胱天冬酶）

2、所有Caspase先以无活性的酶原（procaspase）的形式合成，其激活过程包括：①二聚体化②caspase自身序列裂解成小亚其和大亚基③除去prodomain。

3、最早发现的 caspase 为IL-1β转化酶 (ICE=caspase-1) 它将 pro-IL-1　前体裂解成其活性形式。 ICE 基因转染导致细胞凋亡。此过程可被一种牛痘病毒蛋白CrmA抑制。 CrmA抑制所有caspase。

4、已知该家族成员超过12个，虽然其中某些 caspase参与白细胞介素的成熟，但大多数作用是激活凋亡 。通过在特异性caspase裂解位点(e.g. DEV D)处裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活，从而影响凋亡。

例如：

a. DFF -DNA fragmentation factor- cleavage of an inhibitory subunit activates this nuclease which cuts the DNA into a distinct ladder-likepattern and for chromatin to condense.

b. PARP -Poly-ADP ribose polymerase, a DNA repair enzyme inactivated by caspases

c. nuclear lamin - causes nucleus to lose its structural integrity after cleavage

d. cytoskeletal proteins - cleavage causes membrane blebbing

5、杀伤 T-淋巴细胞可释放颗粒酶（granzymes）于靶细胞上而诱导凋亡： granzymes 裂解和激活 caspase→诱导凋亡

6、现正研究能完全阻断凋亡的caspases抑制剂， 看它们是否能保护中风、心梗和器官移植中细胞免于因缺血诱导的凋亡

四、 Caspases的激活

（一）死亡受体被其配基激活

1、TNF 受体与称为TRADD的蛋白结合，后者再结合 FADD； Fas直接与 FADD结合。

2、FADD结合caspase-8 (又称为 FLICE),它含有死亡结构域同时又具蛋白酶催化活性

3、活化的caspase-8激活凋亡途径.；

4、触发激活的关键是受体的寡聚化。在 Fas系统中 FasL与 Fas 的相互作用导致 Fas 受体形成三聚体,从而激活凋亡。

5、FasL 也是一个单一跨膜蛋白。FasL 既可通过与之相互作用杀死相邻细胞，也可激活细胞自身的Fas而自杀。

（二）Apaf1- caspase活化蛋白

1、Caspase-8裂解 Bid 使其 C-端域易位至线粒体中。

2、Bid及其它 Bcl2家族促凋亡蛋白的作用导致线粒体释放细胞色素C。.

3、Bcl2抑制cytochrome c释放。

4、Cytochrome c 在胞浆中与Apaf-1结合。Apaf-1/cytochrome c经需能的寡聚化形成大的蛋白复合物 (Apoptosome)，后者聚集procaspase-9

5、 procaspase-9经自身裂解而活化。

6、Caspase-9裂解caspase-3和其它caspases，激活凋亡的效应器期 effector phase ）,从而使细胞结构被破坏。

五、IAPs, 抑制caspase 活性的蛋白家族

A. IAPs are inhibitors of apoptosis protein. There are 7 identified IAPs in human.

B. IAPs inhibit apoptosis by inhibiting caspase activities.

C. IAPs provide a safeguard mechanism against minimal activation of the apoptosis program.

D. Several IAPs are overexpressed in tumors.