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染色质免疫共沉淀CHIP 超声问题集锦

丁香园

8401

问题:最近要做CHIP,有一点疑惑:如果超声过程正好把目的基因断开,PCR时应该就检测不到目的基因了啊!有这样的情况吗?

解答:
1. 超声要摸条件,使DNA 片段大都控制在300-500bp(其实200-800bp也可以的),太小了基本都打断了,没法PCR。

2. 设计PCR引物时,产物的长度不要太长100多就可以,产物太长不容易P出来(原因可能就像你想的那样,DNA被打断了)

3. 不同的细胞,不同的固定条件,特别是不同的仪器都不一样的,只能慢慢摸条件,我做ChIP实验,在超声这个地方浪费的时间最多了你说你的条带是100左右,你可以试试:

(1)降低振幅和超声次数(减低的幅度大点)

(2)你确定100bp不是RNA(你电泳前去RNA了吗?),在上样孔前面有没有条带呀(除了超声过了之外,还有可能超声不足,我当时就这样)

问题:最近摸超声条件摸了好一阵子了,感觉条带片段差不多了,怎么做input却扩不出目的基因呢?我的目的基因是318kb,但同时我用其它引物,产物长度分 别为500和800的都能扩出来,唯独想做的目的基因扩不出来,怎么回事呢?用未超声的细胞,目的基因的引物是没有问题的,超声后怎么做不出来了呢?有这 样的情况吗?

解答:未超声的细胞能作出来,说明引物和PCR条件是没有问题的说明是input出了问题(input应该是提了DNA才跑的pcr,不是input直接pcr吧?),而input也就只是超声处理了,说明还是这里出的问题,你超声后片段一般都是多大(超声后直接电泳的,还是提DNA后电泳看的)?可以上个图看看吗?我个人感觉318bp的产物有点大了,100多点就可以,,你说别的产物500/800多能跑出了,这个说明不了太大的问题,毕竟不是一个基因。

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