MTT试验——细节决定成败（三）

一、关于如何计算IC50
　　1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
　　 Xm:lg 最大剂量
　　 I:lg(最大剂量/相临剂量)
　　 P:阳性反应率之和
　　 Pm:最大阳性反应率
　　 Pn:最小阳性反应率
举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：
　　 Pm=0.95
　　 Pn=0.06
　　 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
　　 Xm=lg0.1=-1
　　 lgI=lg0.1/0.01=1
　　 lgIC50=-1-undefined(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
　　 IC50=0.00025
2、Bliss法:自己查阅书籍

　　3、IC50计算软件

　　4、自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似

　　5、在线求IC50或EC50

　　二、结果统计学处理
所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组excel表中可以做两两比较的T-test,这个你可以参考一下；你的数据应该用多个样本均数的T-test，方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。

　　三、孔板的重复利用
培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。建议不要用太多次，即使是进口的板子使用次数也不要超过3次,底值最好在测得值的1/3一下。

强烈建议培养板不要重复使用:1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长，会出现帖壁不好，细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底，如果有万一,则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质.

重复利用时
做法1：
洗净后用2％NaoH浸泡4小时，再用1％稀盐酸浸泡4小时，冲洗15遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干，UV照射过夜(紫外2小时以上消毒即可)

做法2:
泡酸2－4小时，老师让我们别超过4小时，（普通的玻璃仪器是过夜）。捞出，冲洗干净，烘干后，UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起，钴60照射消毒.

做法3:
　 1.做完ＭＴＴ后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。

　 2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干。

　 3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液(六小时以上即可)后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理。

　 4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。

做法4:
　 1、测完值的96孔板甩掉孔内培养液，放入超声中超10-30分钟，晾干(或烘干)备用。此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。

　 2、每孔加入50-100ul的胰酶(0.05%)，我一般加60ul，加完胰酶后水平振荡96孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面，室温下放置至细胞被消化脱落为止。假如你想消化快一点的话可将96孔板放到37度培养箱内(胰酶在37度时的活力最大)。对于顽固贴附在壁上的细胞，此步骤最为有效。

　 3、甩掉胰酶，自来水下冲洗，晾干(或烘干)备用。如果不烘干就泡酸，那么96孔板残留的水分将稀释酸液，长期以往泡酸的效果下降。

　 4、将晾干的96孔板泡酸(中强酸)过夜，捞起后自来水下冲洗10遍；双蒸水冲洗3遍。三蒸水冲洗3遍。烘干备用。泡酸时特别注意时间不要太长了，否则板子变黄，影响最后的OD值的测定。

　 5、做实验前，96孔板至少在紫外灯下照射30分钟，但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄，我的两块板放在超静台上忘了拿出来，一直照了两个星期，等我从超静台上取出板已经变成黄色。

　　注 意：
　 1、在实验中若你测得某一个孔的数值偏高，虽然有很多因素会导致数值偏高，但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再测值。你会发现孔高的值又会到正常水平。因为咱们做实验时手不可避免的接触96孔板板底留下痕迹，这些痕迹就会使吸光度升高。

　 2、96孔板洗的次数多了，板底自然留下划痕，这就会导致读数的不均而影响实验结果。你不妨在做实验前测一次96孔板的值(此值为初值)，实验测得的为后值。后值减去初值就接近实验的真实值