Western Blot经验分享第一弹

Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，不同的是其采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽的类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗起反应，并经过底物显色检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

万类生物成立至今，做过的Western blot实验不下数万板，我们曾经也遇到过跟您一样的困难，最终也一一化解，先将我们在Western blot实验方面积累的一些经验与大家一同分享，希望与大家共同交流：

一、关于蛋白提取：
1. 裂解buffer：每种裂解buffer都有其擅长的用途，市面上常见的裂解buffer见下表：

除了这些裂解buffer以外，为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的；在提取蛋白的时候仅仅靠裂解液有时候也不能达到完全抽提的效果，有条件的话，可以对抽提悬液进行10-20s的超声破碎处理；此外如果没有裂解buffer，可以用1×SDS loading buffer代替来抽提蛋白，其效果类似于SDS裂解液，不过抽提后的样本不能进行浓度测定。

2. 干扰蛋白：培养细胞、动物组织都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白与免疫球蛋白，这些蛋白会经常性的出现杂带干扰，一般白蛋白杂带在70kDa处，免疫球蛋白杂带出现在50kDa处；有人怀疑：“我的抗体也不识别这些蛋白啊！”，现实不是这样的，当某种蛋白含量超过一定量的时候，即使很少的非特异吸附都有可能造成信号的富集而造成杂带；建议广大战友在提取细胞蛋白的时候，一定要使用PBS漂洗细胞至少3次，去除残留的培养基成分；提取组织的时候，尽量去除组织中血液的残留，这样样本中的干扰因素才会减少到最低。

二、关于胶浓度及电泳条件的选择：
正确选择凝胶浓度与电泳条件能够让目的蛋白区域最大限度的分离开，从而使条带的位置，杂带位置等一些因素的影响降到最低；胶浓度及电泳条件的选择见下表：

三、关于转膜的条件与注意事项：
转膜也是一个事关成败的重要因素，但是并不是所有问题都要归咎于“转膜不完全”，如何判断转膜是否合格呢？很多人最先想到的是“丽春红”，在这里我们对此持保留意见，不是说丽春红染色不对或者不好，而是我们完全可以通过预染marker条带的情况间接地判断转膜情况，何必让膜经历一次不必要的染色呢！下面来说说转膜条件：

1. 转膜条件：对于分子量10-15kDa的指标转膜时间不宜过长，100V、冰浴45min足矣；对于分子量指标150kDa以上的指标，100V、冰浴2h也足够了；其他介于15-150kDa之间的指标100V、冰浴1h完全可以保证效果。

2. 转膜操作：准备PVDF膜的大小要与切割后的凝胶大小一致或略小，滤纸和海绵大小也要一致；制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使胶变形，条带弯曲，太薄气泡容易进入，导致条带不完整，这些都可以用增加减少滤纸量来改善；一定要把目的蛋白分子量区域贴在膜的中间部位；分清楚正极与负极，避免反方向转印；转印缓冲液要提前预冷，整个转印过程也需要在冰浴中进行。

四、关于分子量实际与预测结果的差异：
可能导致预测与实际分子量不一样的因素：

1. 预染marker的误差：由于预染marker是由标准蛋白与有色染料偶联而成的，所以偶联后的蛋白由于表面结构的改变，导致在SDS-PAGE中分离的线性关系没有天然蛋白那么好；另外由于偶联的批次不同，每个条带针对每个批次呈现出的分子量会有些许的变化，所以在使用预染marker的时候，出现5-10%的分子量误差是不能避免的，如果需要确切分子量需要用非预染marker来标定；

2. 物种差异：很多蛋白在人源、大鼠源、小鼠源中存在的长度并非完全一致，具体问题还要具体分析；

3. 蛋白本身的性质：

①分子量数值仅仅是一个氨基酸数值累加的相对值，与实际值本身存在差距；

②蛋白质存在磷酸化、乙酰基化、糖基化等翻译后修饰可导致分子量增大，比如常见的CD家族蛋白糖基化修饰以后分子量都会增大许多；

③蛋白质存在翻译后酶前体状态与激活剪切状态，可使分子量变小，比如MMP2蛋白，酶源与激活态大小分别是72kDa、63kDa；

④蛋白质存在多个转录本由一个基因编码的形式，不同的转录本翻译得到的蛋白分子量不一样，比如JNK这个蛋白，本身分为JNK1，JNK2，JNK3三个亚型，三种亚型同源性较高，而且针对每个亚型还有不同分子量的转录本呈现；要想正确把握蛋白分量问题不仅仅要读说明书，还要关注这个蛋白的相关背景知识；

4. uniprot：这个数据库提供了关于蛋白预测分子量，亚型分类，转录本种类及最初发现这个蛋白的一些参考文献，Abcam、Santa cruz等著名抗体公司都有参考这个数据库进行抗体的设计，我们的抗体也是根据此数据库研发的。

五、关于“白板”和“黑板”：
Western结果往往就处于“白板”与“黑板”之间的某个条件：

1. 白板：“白板”代表的意义是某些条件不足：

① 首先要考虑蛋白提取问题，样本浓度是否过低，正常Western实验每孔需要20-40μg左右的蛋白；

② 一抗的稀释比例，一般新手做WB都会按照说明书的比例去做，一般说明书都是1:500-2000之间的比例，如果是白板就需要加大抗体比例，如果按说明书的最低推荐比例还是“白板”，那应该不是稀释比例的问题了；

③ 一抗孵育时间，常规的一抗孵育条件是4℃过夜，有时候抗体反应比较“迟钝”可能需要更强烈的孵育时间，比如延长孵育时间至2天，或者把摇床放入冰箱缓慢摇动孵育过夜，我们不建议37℃进行抗体孵育；

④ 显色体系的选择，一般来说ECL化学发光要比DAB灵敏5-10倍以上，所以尽量使用ECL；ECL发光液也分很多种，普通型、灵敏型、超灵敏型，我们都尝试过，的确在信号上有非常明显的差异；当然延长曝光时间也是提高信号灵敏度最常规的方法；

2. 黑板：“黑板”顾名思义相对于“白板”，“黑板”代表的意义就是某些条件过量了；

① 要考虑上样量；

② 降低一抗稀释比例；

③ 降低二抗稀释比例，二抗其实是非常成熟的产品，质量是有保证的，我们一直在用HRP二抗，1:5000，常温40min，基本不需要摸索二抗条件，总结起来还是一抗、二抗都要买放心厂家的；

④ 缩短曝光时间。

六、关于封闭
封闭也是Western中比较关键的环节，一般常规的条件是5%脱脂奶粉溶于1×TBST中，常温下摇床缓慢摇晃，封闭1h；除此之外还需要向大家介绍另外一种封闭液—0.5% 明胶，这两种封闭液都适用于常规的Western实验，他们之间的取舍关系可近似认为，如果用脱脂奶粉封闭结果是“白板”或者信号较弱，可以考虑换明胶；如果用明胶封闭，结果杂带较多，背景较深可以考虑用脱脂奶粉；甚至有的时候两者可以混合起来使用，具体的细节需要大家在实验中细细品味。

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