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Western blot 实验过程与经验分享

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一、蛋白样品的制备与定量(提取好的蛋白是成功的一半)

(1)提细胞蛋白

① 消化或刮下细胞至 1.5 的 EP 管中,标记,10000r 离心 2 min,PBS 洗 2-3 遍。

② 尽量吸去 EP 管中 PBS,加适量 RIPA 裂解液(RIPA 裂解液+蛋白酶、磷酸酶、PMSF 三联装)。

③ 冰上裂解 30 min~1 h,开 4°离心机。

④ 4°离心 11000r,20 min。

⑤ 取上清,测蛋白浓度,加蛋白上清的四分之一体积 5x 上样 loading buffer,煮沸(95℃ 加热 5 min),分装。

(2)提组织蛋白

① 研钵中倒入液氮,加入组织块,研磨,加液氮,药匙刮。

② 刮下后放入 1.5 ml 的 EP 管,加适量裂解液,吹打。

③ 冰上放置 1 h,期间,每隔 10~15 min 吹打一次或者用震荡仪震荡 2 min。

④ 4°离心 11000r,20 min。

⑤ 取上清,测蛋白浓度,加 1/4 体积 5x loading buffer,煮沸(95℃ 加热 5 min),分装。

(3)测蛋白浓度(BCA 法)

① 八个标准孔,按说明书先加 PBS,再加标准蛋白液

② 目的孔,每孔加 18ulPBS+2ul 目的蛋白

③ 按说明书配 BCA 工作液,每孔加 200ul

④ 37°放置半小时后测浓度

(4)计算上样量,设计上样顺序

上样体积:上样量/浓度 x 5/4

上样顺序:无处理,对照,处理;体积最好不要相差太大

经验总结:

如何提高蛋白浓度:首先当然是多培养点细胞,多提供点组织啦,其次可以少加点裂解液,裂解时间长点,尽量裂解充分。

如何处理蛋白浓度低的问题:实验过程中发现蛋白的浓度太低,如果上样的话,体积太大,甚至电泳孔都装不下,举例:假设我需要上样 40ul 才能达到 20ug,那么显然按照常规的方法,10 孔的梳子只能加 25ul 左右,我们此时可以取 40ul 蛋白入 EP 管中,放置于 PCR 仪器,变性温度浓缩蛋白体积,这样不断浓缩之后促使 EP 管中蛋白的水分降低,蛋白量依旧是 20ug。

如何保证对照组和实验组蛋白浓度大概是一致的:种植细胞的时候计数、铺板,使铺下去的细胞数接近。

二、电泳

1、 清洗玻璃板,去离子水冲,风干或烤干。这步清洗很重要。

2、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒配胶。先配下胶(分离胶),一般两块板配 10 ml 的 10% 的胶(20~80kDa 通用),混匀后灌胶,立即用正丁醇或水封,待凝固后倒出正丁醇或者水,用滤纸吸干;

3、 配上胶(积层胶),一般两块板配 4 ml 的 5% 的胶,混匀后灌胶,插板, 待凝固。

4、将玻璃板装好放入电泳槽中,加电泳液,轻轻拔梳。这步要注意必须要两块板一起。

5、上样

6、 连接电源,一定要注意红对红,黑对黑,定电压和时间,上胶(90v,约 40 min,maker 分出条带),换压,下胶(120v,2 h)。(不要让溴酚蓝跑出去)

经验总结:

胶的浓度根据你所需要跑的蛋白的分子量大小决定,

想要条带跑的好看点,最好把上胶稍微配高一点。

APS 最好现配先用,配制好后放 4 度避光保存,最多保存一周。

胶最好现配现用,如果需要保存最好用湿润的保鲜膜包好

TEMED 可以催化过硫酸铵产生自由基,所以要注意是否过期失效,主要避光保存。

三、转膜(整个 WB 过程中最重要的环节)

① 跑到溴酚蓝距离靠近最下缘时,要提前准备半干法转膜液。

② 在电转液中剥胶,裁胶,剪膜,膜活化。

③ 「三明治」黑板~海绵~三层滤纸~胶~膜(正面朝下,分清左右,与胶对应)~3 层滤纸~海绵~白板,夹紧后放入电转槽中。(海绵,滤纸,膜需浸润透,过程中不能干,赶走气泡)。

④ 连接电源,一定要注意红对红,黑对黑,定电流和时间。

经验总结:

溴酚蓝跑到最终的距离是根据你所需要切的分子量决定的。

滤纸和 PVDF 膜的裁剪必须要整齐,干净,标记清晰。

PVDF 膜型号的选择要正确。如正常的 30~170kDa 的分子一般需要孔径 0.45 mm 的膜就足够了。太小的则需要选择孔径为 0.22 mm 的膜。

关于转膜是否要加 SDS 的问题。SDS 带负电,加 SDS 一般是针对那些分子大的 WB,加入 SDS 可以增加分子导电性,这样更利于转膜。

关于转膜电流,分子是否能够转过去和转膜时间没有必要关系,而更在于转膜电流的大小。举个例子,200kDa 的分子量,你用 90mAh 就算转一年都转不过去。

四、免疫印迹

① 膜处理(甲醇 1 min,风干(放滤纸上),甲醇 1 min,水 1 min)。

② 封闭(Western 封闭液)1 h 配摇床。

③ 加一抗,牛奶稀释所需浓度参考抗体说明书,根据膜的大小稀释一抗,4°过夜。

④ 室温孵育 20 min。

⑤ 0.1%TBST 洗 10 min x 3 次配摇床(0.1%TBST:tris12.1 g,NaCl87.66 g,HCl 至 PH7.6 后定容至 1L 后,加入 1 ml 的 TWEEN20)。

⑥ 加二抗,牛奶稀释(根据说明书上进行稀释),1 h 配摇床

⑦ 0.1%TBST 洗 10 min x 3 次配摇床。

⑧ 发光(显影定影试剂盒)(A 液 B 液等体积混合,孵膜 1 min,正面朝上放入仪器内发光)。

经验总结:

封闭液的选取具体得看抗体说明书,有的抗体是明确要求只能用 BSA,而且封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求,但是一般情况 5%BSA 的效果会比 5% 牛奶要好。

信号通路一般都是用 5%BSA 封闭。且洗膜的时候用快速摇床 5 min/次 3 次就可以了。

如果你想省时间,一抗可以放在 37℃1~2 hour,但是一定要封好,以免温度太高而导致抗体干了出现假阳性。二抗可以 37℃ 半个小时。

发光液的选取,如果是一般的抗体,建议用一般的发光液效果会好一点,背景会比较干净。但是一些难发出来的一般建议用 ECL 超敏化学发光试剂盒。

Western Blot 做顺的时候很简单,要不顺的时候会被它折磨死。所以内参的选择显的尤为重要。

接下来讲讲怎么做好对照组实验,即怎么选择内参。

1. 内参的重要性:

内参即是内部参照 (Internal Control),内参一般是指由管家基因编码表达的蛋白 (Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对比较恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

在 Western Blot 实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性与严谨性。

2. 如何选择合适的细胞核内参抗体?

常用的总蛋白内参即 GAPDH 和细胞骨架蛋白β-Actin 或β-Tubulin 等;

对于一些植物的样本,则需要特别的植物 Actin 蛋白作为内参;

当实验样品中只是核蛋白,而不是细胞总蛋白提取液时,可以用:核纤层蛋白 B 即 Lamin B 为核内参抗体。

另外,小伙伴们还需要根据目的蛋白的大小选择合适的核内参,推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差 5KD 以上,因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参。

3.目的蛋白表达部位:

就一般的蛋白检测来说,Actin、β-actin、β-Tubulin 抗体等就可以了,而针对于核蛋白的定量,特别是样本蛋白就是核蛋白时,选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有 Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其而对于膜蛋白检测,常用的内参抗体为 Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测,常用 VDAC1 和 COX IV 作为内参抗体。

以上几条原则只是针对通常情况,但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实际的实验环境,比如某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致 GAPDH 的表达增高,不适合做内参。

比如在涉及细胞增殖相关试验中,c-Jun 由于自身表达变化就不适合做内参; 而在凋亡实验时,TBP、Lamin 等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献,在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常,应考虑这方面因素。

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