Western blot 实验过程与经验分享
上海威奥
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一、蛋白样品的制备与定量（提取好的蛋白是成功的一半）
（1）提细胞蛋白
① 消化或刮下细胞至 1.5 的 EP 管中，标记，10000r 离心 2 min，PBS 洗 2-3 遍。
② 尽量吸去 EP 管中 PBS，加适量 RIPA 裂解液（RIPA 裂解液+蛋白酶、磷酸酶、PMSF 三联装）。
③ 冰上裂解 30 min~1 h，开 4°离心机。
④ 4°离心 11000r，20 min。
⑤ 取上清，测蛋白浓度，加蛋白上清的四分之一体积 5x 上样 loading buffer，煮沸（95℃ 加热 5 min），分装。
（2）提组织蛋白
① 研钵中倒入液氮，加入组织块，研磨，加液氮，药匙刮。
② 刮下后放入 1.5 ml 的 EP 管，加适量裂解液，吹打。
③ 冰上放置 1 h，期间，每隔 10~15 min 吹打一次或者用震荡仪震荡 2 min。
④ 4°离心 11000r，20 min。
⑤ 取上清，测蛋白浓度，加 1/4 体积 5x loading buffer，煮沸（95℃ 加热 5 min），分装。
（3）测蛋白浓度（BCA 法）
① 八个标准孔，按说明书先加 PBS，再加标准蛋白液
② 目的孔，每孔加 18ulPBS+2ul 目的蛋白
③ 按说明书配 BCA 工作液，每孔加 200ul
④ 37°放置半小时后测浓度
（4）计算上样量，设计上样顺序
上样体积：上样量/浓度 x 5/4
上样顺序：无处理，对照，处理；体积最好不要相差太大
经验总结：
如何提高蛋白浓度：首先当然是多培养点细胞，多提供点组织啦，其次可以少加点裂解液，裂解时间长点，尽量裂解充分。
如何处理蛋白浓度低的问题：实验过程中发现蛋白的浓度太低，如果上样的话，体积太大，甚至电泳孔都装不下，举例：假设我需要上样 40ul 才能达到 20ug，那么显然按照常规的方法，10 孔的梳子只能加 25ul 左右，我们此时可以取 40ul 蛋白入 EP 管中，放置于 PCR 仪器，变性温度浓缩蛋白体积，这样不断浓缩之后促使 EP 管中蛋白的水分降低，蛋白量依旧是 20ug。
如何保证对照组和实验组蛋白浓度大概是一致的：种植细胞的时候计数、铺板，使铺下去的细胞数接近。
二、电泳
1、 清洗玻璃板，去离子水冲，风干或烤干。这步清洗很重要。
2、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒配胶。先配下胶（分离胶），一般两块板配 10 ml 的 10% 的胶（20~80kDa 通用），混匀后灌胶，立即用正丁醇或水封，待凝固后倒出正丁醇或者水，用滤纸吸干；
3、 配上胶（积层胶），一般两块板配 4 ml 的 5% 的胶，混匀后灌胶，插板, 待凝固。
4、将玻璃板装好放入电泳槽中，加电泳液，轻轻拔梳。这步要注意必须要两块板一起。
5、上样
6、 连接电源，一定要注意红对红，黑对黑，定电压和时间，上胶（90v，约 40 min，maker 分出条带），换压，下胶（120v，2 h）。（不要让溴酚蓝跑出去）
经验总结：
胶的浓度根据你所需要跑的蛋白的分子量大小决定，
想要条带跑的好看点，最好把上胶稍微配高一点。
APS 最好现配先用，配制好后放 4 度避光保存，最多保存一周。
胶最好现配现用，如果需要保存最好用湿润的保鲜膜包好
TEMED 可以催化过硫酸铵产生自由基，所以要注意是否过期失效，主要避光保存。
三、转膜（整个 WB 过程中最重要的环节）
① 跑到溴酚蓝距离靠近最下缘时，要提前准备半干法转膜液。
② 在电转液中剥胶，裁胶，剪膜，膜活化。
③ 「三明治」黑板~海绵~三层滤纸~胶~膜（正面朝下，分清左右，与胶对应）~3 层滤纸~海绵~白板，夹紧后放入电转槽中。（海绵，滤纸，膜需浸润透，过程中不能干，赶走气泡）。
④ 连接电源，一定要注意红对红，黑对黑，定电流和时间。
经验总结：
溴酚蓝跑到最终的距离是根据你所需要切的分子量决定的。
滤纸和 PVDF 膜的裁剪必须要整齐，干净，标记清晰。
PVDF 膜型号的选择要正确。如正常的 30~170kDa 的分子一般需要孔径 0.45 mm 的膜就足够了。太小的则需要选择孔径为 0.22 mm 的膜。
关于转膜是否要加 SDS 的问题。SDS 带负电，加 SDS 一般是针对那些分子大的 WB，加入 SDS 可以增加分子导电性，这样更利于转膜。
关于转膜电流，分子是否能够转过去和转膜时间没有必要关系，而更在于转膜电流的大小。举个例子，200kDa 的分子量，你用 90mAh 就算转一年都转不过去。
四、免疫印迹
① 膜处理（甲醇 1 min，风干（放滤纸上），甲醇 1 min，水 1 min）。
② 封闭（Western 封闭液）1 h 配摇床。
③ 加一抗，牛奶稀释所需浓度参考抗体说明书，根据膜的大小稀释一抗，4°过夜。
④ 室温孵育 20 min。
⑤ 0.1%TBST 洗 10 min x 3 次配摇床（0.1%TBST：tris12.1 g，NaCl87.66 g，HCl 至 PH7.6 后定容至 1L 后，加入 1 ml 的 TWEEN20）。
⑥ 加二抗，牛奶稀释（根据说明书上进行稀释），1 h 配摇床
⑦ 0.1%TBST 洗 10 min x 3 次配摇床。
⑧ 发光（显影定影试剂盒）（A 液 B 液等体积混合，孵膜 1 min，正面朝上放入仪器内发光）。
经验总结：
封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用 BSA，而且封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况 5%BSA 的效果会比 5% 牛奶要好。
信号通路一般都是用 5%BSA 封闭。且洗膜的时候用快速摇床 5 min/次 3 次就可以了。
如果你想省时间，一抗可以放在 37℃1~2 hour，但是一定要封好，以免温度太高而导致抗体干了出现假阳性。二抗可以 37℃ 半个小时。
发光液的选取，如果是一般的抗体，建议用一般的发光液效果会好一点，背景会比较干净。但是一些难发出来的一般建议用 ECL 超敏化学发光试剂盒。
Western Blot 做顺的时候很简单，要不顺的时候会被它折磨死。所以内参的选择显的尤为重要。
接下来讲讲怎么做好对照组实验，即怎么选择内参。
1. 内参的重要性：
内参即是内部参照 (Internal Control)，内参一般是指由管家基因编码表达的蛋白 (Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对比较恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
在 Western Blot 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性与严谨性。
2. 如何选择合适的细胞核内参抗体？
常用的总蛋白内参即 GAPDH 和细胞骨架蛋白β-Actin 或β-Tubulin 等；
对于一些植物的样本，则需要特别的植物 Actin 蛋白作为内参；
当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用：核纤层蛋白 B 即 Lamin B 为核内参抗体。
另外，小伙伴们还需要根据目的蛋白的大小选择合适的核内参，推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差 5KD 以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参。
3．目的蛋白表达部位：
就一般的蛋白检测来说，Actin、β-actin、β-Tubulin 抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有 Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为 Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用 VDAC1 和 COX IV 作为内参抗体。
以上几条原则只是针对通常情况，但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实际的实验环境，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致 GAPDH 的表达增高，不适合做内参。
比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun 由于自身表达变化就不适合做内参; 而在凋亡实验时，TBP、Lamin 等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。
