【转帖】Western Blot 实验过程
丁香园论坛
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转至于http://www.51protocol.com/pro/WesternBlotting/20071031/38742_2.html
初涉WB，与大家一起学习：）
样品处理 由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。
注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。
培养的细胞（定性）：
1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2. 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
3. 100℃，1min。
4. 用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
5. 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
6. 待样品恢复到室温后上样。
培养的细胞（定量）：
1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2. 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3. 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
4. 12000g离心，4℃，2min。
5. 取少量上清进行定量。
6. 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
组织：
1. 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。
2. 12000g离心，4℃，2min。
3. 取少量上清进行定量。
4. 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
电泳
1. 上样前将胶板下的气泡赶走。
2. 所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。
3. 以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。
4. 在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
转膜
1. 电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。
2. 取胶：
将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）
3. 转膜：
湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
封闭及杂交
封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST或 TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。
1. 封闭：
将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2. 结合一抗：
一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3. 洗涤：
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4. 结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5. 洗涤：
二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
发光鉴定
Western blot检测系统中常用交联酶两大家族就是辣根过氧化物酶HRP-ECL或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统-包括固定化抗原（WB）监测和核酸检测。但是做AP实验经常会遇到显色背景偏高的问题，所以就WB本身来说偏爱HRP的要比AP多。AP显色底物的生成物主要是蓝紫色，成像好，容易拍照。但是背景也偏高，整个显色过程更有技术性，有许多个人技巧在里面。如今由于HRP系统的化学发光系统已经不断改进，使得灵敏度不断提高，化学发光显色上与AP不相上下。就生色反应来说，AP显色得灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。
1. HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2. AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
注：背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。
增强敏感性
若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：
1. 用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。
2. 将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。
3. 封闭40~60min。
4. 一抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。
5. PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
6. 二抗杂交，37℃ 1h。
7. PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
8. 发光鉴定。
9. 若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
10. 三抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。
11. PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
12. 发光鉴定。
注：一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后可4℃存放至少2周。
NC膜的多次使用
一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“增强敏感性”相近。
1． 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。
2． 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用?strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
初涉WB，与大家一起学习：）
样品处理 由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。
注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。
培养的细胞（定性）：
1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2. 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
3. 100℃，1min。
4. 用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
5. 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
6. 待样品恢复到室温后上样。
培养的细胞（定量）：
1. 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2. 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3. 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
4. 12000g离心，4℃，2min。
5. 取少量上清进行定量。
6. 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
组织：
1. 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。
2. 12000g离心，4℃，2min。
3. 取少量上清进行定量。
4. 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
电泳
1. 上样前将胶板下的气泡赶走。
2. 所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。
3. 以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。
4. 在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
转膜
1. 电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。
2. 取胶：
将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）
3. 转膜：
湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
封闭及杂交
封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST或 TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。
1. 封闭：
将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2. 结合一抗：
一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3. 洗涤：
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4. 结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5. 洗涤：
二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
发光鉴定
Western blot检测系统中常用交联酶两大家族就是辣根过氧化物酶HRP-ECL或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统-包括固定化抗原（WB）监测和核酸检测。但是做AP实验经常会遇到显色背景偏高的问题，所以就WB本身来说偏爱HRP的要比AP多。AP显色底物的生成物主要是蓝紫色，成像好，容易拍照。但是背景也偏高，整个显色过程更有技术性，有许多个人技巧在里面。如今由于HRP系统的化学发光系统已经不断改进，使得灵敏度不断提高，化学发光显色上与AP不相上下。就生色反应来说，AP显色得灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。
1. HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2. AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
注：背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。
增强敏感性
若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：
1. 用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。
2. 将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。
3. 封闭40~60min。
4. 一抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。
5. PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
6. 二抗杂交，37℃ 1h。
7. PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
8. 发光鉴定。
9. 若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
10. 三抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。
11. PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
12. 发光鉴定。
注：一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后可4℃存放至少2周。
NC膜的多次使用
一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“增强敏感性”相近。
1． 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。
2． 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用?strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
