免疫荧光实验的几个问题

1、问：做间接法免疫荧光染色，要怎么设置对照？

参考见解：最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。

（1）空白对照：如果你作的是石蜡切片的免疫组化，这一个对照必须有，目的是看自发荧光。脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。

（2）阴性对照：标本直接滴加二抗，呈阴性反应。

（3）抗原对照：标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。

2、问：免疫荧光：用免疫荧光方法做同样的内容，组织切片和培养细胞，两者操作过程中有哪些不同？

参考见解：只是固定方法不同，细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。

（1）你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光。

（2）封片最好用甘油加0。5mmol/L pH9。0-9。5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明更亮。

（3）关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内缘性过氧化物酶。

（4）如果要做苏木素复染，可用盐酸溶液去除苏木素。

3、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤以及注意事项？

参考见解：我正在做冰冻组织切片的免疫荧光的双染。有些体会：

（1）选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，secondary antibodies则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

（2）我的做法是两种primary antibodies同时孵育，然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好，背景比较干净。

（3）我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

（4）Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清，我的是10%的正常donkey血清。

（5）其余同一般操作。

4、问：我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好，有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光纤维镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢？

参考见解：激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。抗体分装、及荧光显微镜观察结果是否一定要在暗室中进行实验。

1. 首先我们要熟悉激光共聚焦的使用方法，开机和关机顺序要注意，尤其是激光器的使用，务必要预热 10 到 15 分钟方可打开激光。

2. 在 smart set up 中选择 best signal，对应相应的激光波长选择相应的颜色（488-FITC，568-RHOD，647-White，后期也可在软件中进行修改）。

3. 拍摄过程中要注意选择的像素和拍摄速度，一般选择 102undefined1024，speed 为 5-7。

4. Pinhole 值不宜过大，在操作过程中可点击 1AU-Max，获得荧光强度适宜的图层。

5. 为拍摄出完美的荧光图，可通过调整 Gain 值改变荧光强度，再通过调整 Digital Offset 和 Digital Gain 来降低背景噪音以及调整荧光强度。（作者：不 2 兔，图片：不 2 兔，封面：丁香通）