正常小鼠原代脑星形胶质细胞培养
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正常小鼠原代脑星形胶质细胞培养
一、实验试剂
1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、检测试剂：抗小鼠CD 11b/c抗体，荧光标记二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）
二、实验器械
1、培养皿
2、培养瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科镊和止血钳
5、10ml注射器
6、玻璃滴管
7、烧杯
8、15ml离心管
三、实验流程
取材
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去除大脑脑膜及血管,剔除海马部分
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1 × PBS （pH 7.4 ）漂洗3次，去掉表层血丝
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先用眼科镊将组织撕碎成糜状，用眼科剪反复剪10min，再用移液器轻轻吹打20~30次。
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将组织转移至15ml离心管中，加入消化液（PriCells）
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将离心管放置到37℃，15-20min水浴恒温消化
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加入消化终止液（PriCells）终止反应
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离心，1000rmp,10min，弃去上清
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重悬，计数细胞
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接种密度以1 × 106 个/ml
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培养37℃，5%CO2
四、实验 操作
1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：正常昆明小鼠（生后24h内）。
3、材料预处理：将小鼠处死后浸泡入体积分数75% 乙醇中消毒，以血管钳从后夹住颈部，用眼科剪从枕部向前依次分开头皮及颅骨，再用眼科镊依次剥离，剔除脑膜及血管。取大脑（剔除海马部分）置于1 × PBS （pH 7.4 ）中，漂洗去表层血丝，至脑组织呈乳白色。
4、消化液：用眼科镊将组织撕碎成糜状，再用眼科剪反复剪10min，最后再用移液枪轻轻吹打20~30次，将剪碎的组织用枪转移至15ml离心管中，37℃水浴消化15min。
5、终止消化：按1：1加入消化终止液，中止酶反应。
6、收集重悬细胞：1000 rpm，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬，染色计数细胞。
7、培养细胞密度：调整细胞密度以1 × 106 个/ml 接种入培养瓶。
8、培养：放置于37℃，5% CO2 培养箱中。
五、细胞鉴定
1、显微鉴定：相差显微镜下，可见细胞呈星形状，细胞密度增高后呈现鹅卵石样镶嵌排列，有接触抑制的特点。细胞具备良好的透光性。
2、免疫组织化学鉴定 ：利用OX-42 （CD 11b/c）免疫荧光染色。
3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×104 个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。
4、细胞固定：用PBS洗涤细胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空气中自然干燥。
5、特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min。
6、洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
7、标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。
洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
8、封片：封片剂封片。
9、镜检：荧光显微镜下观察，胶质细胞包质呈现较强黄绿色荧光，细胞核周围尤其明显。
六、注意事项
1、选材注意选取新生昆明小鼠（24h内）。取材过程尽可能保证无菌，尽量剔除脑膜及血管和海马部分。
2、注意尽可能消除脑组织表面的残血，避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。
3、胶质细胞分离损伤严重影响胶质细胞的生长，因此应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。
4、严格控制胶质细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。
5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中，可以酌情考虑是否包被。
6、传代培养细胞接种量为1×106 个（25 cm2 培养瓶），细胞倍增时间为36小时。细胞传代培养最佳为5-8代， 传代次数增加，细胞体积增大，细胞之间间隙增加，细胞贴壁牢固，传代消化时间会有所延长。
