正常小鼠原代真皮纤维原细胞培养

正常 小鼠原代真皮纤维原细胞培养

一、实验试剂

1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement

2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO

3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S

4、染色液： 0.4% Trypan Blue

5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit

6、检测试剂：抗小鼠Fibronectin抗体，荧光标记二抗，乙醇丙酮混合液（1：1）

二、实验器械

1、培养皿

2、培养瓶

3、直剪和眼科剪

4、眼科镊

5、玻璃滴管

6、15ml离心管

7、200目网筛

三、实验流程

四、实验操作

1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。

2、取材：从小鼠身上取皮片，削成厚度为0.5mm左右的皮片；

3、材料预处理：将皮片浸泡在75%的酒精中消毒；用1 × PBS （pH 7.4 ）清洗两遍（每次约5min）以清除血细胞；

4、初步消化：将皮片剪成（3-5）mm×（10-15）mm大小，去除皮下组织；将裁剪好的皮块置于消化液中4℃消化过夜；第二天，取出消化好的细胞，用镊子尽可能剥去表皮，并刮去真皮下的其他组织；

5、再次消化：处理好后，将组织块剪成1mm3 左右，加入消化液，37℃震荡消化至消化液浑浊（1h左右）；

6、中止消化：中止酶反应，悬液过200目网筛；

7、收集重悬细胞：收集细胞悬液，800rpm离心5min；弃上清，用培养基重悬细胞，重复离心一次；

8、细胞密度计数：培养基重悬细胞，0.4% Trypan Blue染色计数，以5×105 的数量接种于培养瓶中。

9、培养：放置于37℃，5% CO2 培养箱中。

五、细胞鉴定

1、显微鉴定：相差显微镜下，可见细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。细胞具备良好的透光性。

2、免疫组织化学鉴定 ：利用Fibronectin相关抗原检测。

3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×104 个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。

4、细胞固定：用PBS洗涤细胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空气中自然干燥。

5、特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min。

6、洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。

7、标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。

洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。

8、封片：封片剂封片。

9、镜检：荧光显微镜下观察。

六、注意事项

1、选材注意时要将皮肤组织上的被毛去除干净，也可以使用还未长出被毛的乳鼠进行试验。

2、注意尽量将皮片剪成（3-5）mm ×（10-15）mm大小，如太大则不利于消化，太小则不利于真皮、表皮的物理分离。

3、过度消化损伤严重影响成纤维细胞的生长，因此应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。

4、严格控制成纤维细胞的培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。

5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中，可以酌情考虑是否包被。

6、传代培养细胞接种量为5×104 个（25 cm2 培养瓶），细胞倍增时间为48小时。细胞传代培养最佳为4-7代， 传代次数增加，细胞体积增大，细胞之间间隙增加，细胞贴壁牢固，传代消化时间会有所延长。

七、 PriCells 细胞图片