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正常小鼠原代骨骼肌细胞培养

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13900

正常小鼠原代骨骼肌细胞培养

一、实验试剂

1、培养基: PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement

2、冻存液: PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO

3、洗涤液: 1 × PBS (pH 7.4 )+ 1% P/S

4、染色液: 0.4% Trypan Blue

5、消化液: PriCells Isolation of Primary Cell Kit

6、检测试剂:鼠抗人及大鼠desmin一抗,肌球蛋白(myosin)单克隆抗体

二、实验器械

1、培养皿

2、培养瓶

3、直剪和眼科剪

4、眼科镊和止血钳

5、烧杯

6、15ml离心管

三、实验流程

取肌肉于平皿,Hank’s洗3次
剔除脂肪、结缔组织
肌肉标本剪约0.1cm3小块
移至离心管,Hank’s洗3次
静置1min,弃去上层液及漂浮组织
0.25%胰酶,37度水浴消化20min,每5min摇动或吹打1次
生长培养基终止消化,反复吹打,依次100,200,400目过筛
离心,1000rmp,10min,弃去上清
重悬,计数细胞,接种密度以5 × 105 个/ml
悬液加入未经PPL包被培养瓶中,差速贴壁去除成纤维细胞,37度,1h
转移包被瓶中,生长培养基培养,培养37℃,5%CO2
4d换液,以后每天换

四、实验 操作

1、 新生小鼠拉颈椎处死,乙醇消毒腿部,在超净工作台内,取肌肉于平皿,Hank’s洗3次,剔除脂肪、结缔组织,将肌肉标本剪约0.1cm3小块;

2、 将剪碎的肌肉移至离心管,Hank’s洗3次,静置1min,弃去上层液及漂浮组织;

3、 向上述离心管中加入0.25%胰酶,37度水浴消化20min,每5min摇动或吹打1次离心管,然后加入生长培养基终止消化;

4、 反复吹打后,依次100,200,400目过筛,滤液收集后,1000r/min离心10min;

5、 弃去清夜,用生长培养基重悬细胞,悬液加入未经PPL包被的培养瓶中,差速贴壁去除成纤维细胞,37度培养1h后,转移包被瓶中,生长培养基培养,4d换液,以后每天换液1次。

五、细胞鉴定

1、显微鉴定:刚分离出的原代细胞比较小,呈球形,折光性强。12h后,细胞开始贴壁,72h后贴壁完全,细胞逐渐延展成梭形,随着培养时间的延长,细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列。当细胞融合80%以上后,开始形成肌管。

2、免疫细胞化学染色1:肌卫星细胞胞浆中含有结蛋白(desmin),可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗对卫星细胞进行免疫染色鉴定。

3、免疫细胞化学染色2:采用骨骼肌特异性的肌球蛋白(myosin)单克隆抗体检测。取含骨骼肌细胞盖玻片常规处理后进行myosin的细胞免疫化学染色,PBS代替一抗做阴性对照。结果判定:以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。

六、注意事项

1、胰酶消化过程中,也可采用15min两步消化的方法进行。根据所取组织个体年龄决定,一般成年大小鼠采用两步消化效果好,幼鼠一步消化和两步消化差别不大。

2、传代培养代数不要太多,骨骼肌细胞传代能力有限,容易死亡。

3、骨骼肌细胞培养过程中,形态会发生较大变化。

4、肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织。
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