原代培养结肠平滑肌细胞

实验步骤

（一）、取SD 大鼠一只，实验时断椎处死。

（二）、在无菌条件下快速自肛门上2 cm 取结肠10 cm 左右，生理盐水中反复灌肠冲洗。

（三）、移入含300 U/ml青霉素、300 U/ml 链霉素的HepesRinger缓冲液中浸泡，肠段内外各15 min。

（四）、将经抗生素浸泡过的肠段移入含Hepes Ringer缓冲液的塑料培养板中（培养板预先铺上705胶），在体视显微镜下沿肠系膜对侧纵行切开肠段，皮内针固定好四角，仔细地刮除粘膜层，翻转至外侧，小心地撕去肠系膜，再仔细地刮去浆膜层。

（五）、反复用镊子侧角刮肠段的内、外层，直至余下的组织层在体视显微镜下观察到呈透明的一层为止。将组织层剪碎匀浆，加入到4 ml 含0.1% Ⅱ 胶元酶和0.01% 大豆胰蛋白酶抑制剂的消化液中，30 ℃ 恒温水浴震荡20 min，离心，弃消化液。

（六）、再加入6 ml消化液，30 ℃ 恒温水浴震荡30 min，加对倍缓冲液中止消化，用滴管反复轻柔吹打。

（七）、1000 r/min离心5 min，用10 ml DMEM 培养液重悬细胞。

（八）、过100目细胞筛网，取细胞滤液用Trypan 蓝染色检查细胞活性，确认活细胞在90% 以上。

（九）、用DMEM 培养液将细胞浓度调整至5×104/ml，接种至培养瓶中，放入培养箱内，37℃ 95% O2 和5%CO2条件下培养。

（十）、细胞培养24 h 后换液，弃去未贴壁细胞，加入培养液继续培养，以后每3～4 天换液1次，期间用倒置显微镜观察细胞生长情况。细胞培养14 d 后，细胞可长成致密单层，即可传代培养。