膀胱平滑肌细胞原代培养

1、麻醉后消毒，下腹正中切口于膀胱颈（结扎处远端约1~2cm），严格无菌操作取出标本、手术台位于超净台旁

2、在超净台，40u/ml庆大霉素溶液中浸泡5分钟

3、生理盐水漂洗1次

4、D－hanks液漂洗1次

5、放入D－hanks液中，除去粘膜、粘膜下及浆膜

如果是Shame组兔，以10ml注射器抽取约8ml D－hanks液，于粘膜层下注射起泡后，剪去粘膜层，直接剪取平滑肌组织，弃浆膜层及其上未剪下之肌组织。

new: 如果是不全BOO兔，则可将膀胱剪成宽约0.5cm之条状，撕去粘膜层后，助手以一眼科镊将该组织一端固定，眼科镊与该组织垂直，并夹持整个横截面，术者同法夹持于附近，助手持第3把眼科镊提起肌组织，术者以手术刀锐性分离肌层；如此，向另一端推进，锐性分离肌条。

6、在超净台，取相当于0.5为X0.5 CM2肌块，室温下将其剪碎成1~2mm碎组织块

7、转移入离心管

8、加入D－hanks液(操作成功)　OR　Dulbecco

9、离心1000转/min，10分钟 离心半径13cm?弃上清

10、加入I型胶原酶（2mg/ml） 5mg,(II型胶原酶2mg/ml 5mg也可，但效果不如I型胶原酶)

11、不要加入DMEM为主要成分的培养液(否则胰蛋白酶失活)

12、转移入培养瓶中

13、4度下过夜孵育。

14、加0.25%胰蛋白酶,36.5度振荡消化15~30min,弃上清。

15、200目(74um)不锈钢网过滤。(可省)，转移入离心管,**吹打后待可见物沉淀，吸尽沉淀（避免组织块培养法）

16、离心1000转/min，10分钟 离心半径13cm?弃上清

18、加培养液至10ml(ok)

17、转移入培养瓶中

19、CO2恒温箱中培养

20、12h后收集未贴壁细胞并计数