方案23.14 从成年骨骼肌分离和培养成肌细胞
最新修订时间：
原理
在添加 20 %（fetal bovine serum，FBS）的 Ham’s F12 培养中，原代细胞容易生长。在不改变培养条件的情况下，这些细胞增殖和分化，融合形成多个细胞核的肌管。这证明培养的细胞具有成肌性。
材料与仪器
D-PBSA
转运培养液 生长培养液 链酶菌蛋白酶液
尼龙网 手术刀 锋利的长剪刀 Petri培养皿 培养瓶 20ml离心管或一般容器 血细胞计数板
转运培养液 生长培养液 链酶菌蛋白酶液
尼龙网 手术刀 锋利的长剪刀 Petri培养皿 培养瓶 20ml离心管或一般容器 血细胞计数板
步骤
一、分离
1. 用手术刀切除活检组织块上的非肌性组织，然后用 D-PBSA 浸洗。
2. 称重前，与肌纤维平行将切除活检组织切成片，用冲洗。
3. 将组织片平行放入 Petri 培养皿盖内，切成较薄的柱状组织块，然后切成 1 mm3 小块。不要挤压组织。也可在试管内用长剪刀将组织剪成小块，应避免挤压组织。
4. 用 D-PBSA 浸洗组织块，静置后吸去上清液。
5. 在 37°C 条件下，用链酶菌蛋白酶液（0.15 % 链酶菌蛋白酶（Sigma P-6911）、0.03% EDTA（Merck 8418）、20 IU/ml 青霉素和 20 μg/ml 链霉素（0.4% Eurobio PES3000），用 Ham F12 或 D-PBSA 配制，100ml）消化组织块 1 h。每 1~3 mg 组织块用 15 ml 链酶菌蛋白酶液。每间隔 10~15 min 轻轻摇晃试管。
6. 孵育后用吸管研磨组织块。由于越来越多的细胞分离下来，培养液会逐渐变得浑浊。
7. 让组织块沉到试管的底部，形成沉降的组织块（P1 ) 和上清液（S1）。
8. 用孔径为 100 μm 的尼龙网将 S1 滤入 20 ml 离心管。轻轻摇晃或用吸管吹打上清液，使细胞混悬。
9. 离心（350 g，8~10 min）后，吸去上清液。
10. 准确加入 10 ml 生长培养液（Ham F12，添加 20 % FBS （Gibco 011-06290），200 ml），用带有橡皮吸头的吸管很轻微地混悬细胞。然后，用血细胞计数板计数细胞。
11. 用生长培养液稀释细胞悬液，以约 1.5×104 个/ml 的细胞密度将细胞接种于培养瓶。从 1 g 健康供体活检组织约获得 1~2×105个细胞。
12. 将 15 ml 消化液加入 P1，在 37°C 水浴中孵育组织块 30 min，并定时摇晃。
13. 用吸管吹打细胞悬液，使细胞分散。然后，用尼龙网过滤细胞悬液。用 20 ml 生长培养液浸洗滤网。
14. 离心（350 g，8~10 min）后，计数细胞，按上述方法接种细胞。
15. 将培养瓶移入湿润的培养箱，在 37°C 和 5 % CO2 的条件下培养细胞。
二、维持培养
16. 接种后 24 h 很轻微地换培养液，以后每 3~4 d 换液 1 次。细胞主要向着分化生长。人成肌细胞的生长分 3 期，培养后 4~6 d 增殖达髙峰；8 d 左右排列成行；10~12 d 细胞融合和形成肌管增多。然而，必须记住一些细胞可能分化较早，绝大多数细胞分化时一些细胞仍处于增殖状态。
三、传代培养
17. 将少量 EDTA 轻轻注在细胞上面后立即吸去。
18. 加入 0.25 % 胰蛋白酶液，足以在细胞上面形成一薄层。
19. 当细胞去附着时，加入 5~10 ml 完全生长培养液，用吸管很轻微地吹打细胞，然后离心（350 g，10 min）。
20. 计数细胞，按一定密度种植细胞。
1. 用手术刀切除活检组织块上的非肌性组织，然后用 D-PBSA 浸洗。
2. 称重前，与肌纤维平行将切除活检组织切成片，用冲洗。
3. 将组织片平行放入 Petri 培养皿盖内，切成较薄的柱状组织块，然后切成 1 mm3 小块。不要挤压组织。也可在试管内用长剪刀将组织剪成小块，应避免挤压组织。
4. 用 D-PBSA 浸洗组织块，静置后吸去上清液。
5. 在 37°C 条件下，用链酶菌蛋白酶液（0.15 % 链酶菌蛋白酶（Sigma P-6911）、0.03% EDTA（Merck 8418）、20 IU/ml 青霉素和 20 μg/ml 链霉素（0.4% Eurobio PES3000），用 Ham F12 或 D-PBSA 配制，100ml）消化组织块 1 h。每 1~3 mg 组织块用 15 ml 链酶菌蛋白酶液。每间隔 10~15 min 轻轻摇晃试管。
6. 孵育后用吸管研磨组织块。由于越来越多的细胞分离下来，培养液会逐渐变得浑浊。
7. 让组织块沉到试管的底部，形成沉降的组织块（P1 ) 和上清液（S1）。
8. 用孔径为 100 μm 的尼龙网将 S1 滤入 20 ml 离心管。轻轻摇晃或用吸管吹打上清液，使细胞混悬。
9. 离心（350 g，8~10 min）后，吸去上清液。
10. 准确加入 10 ml 生长培养液（Ham F12，添加 20 % FBS （Gibco 011-06290），200 ml），用带有橡皮吸头的吸管很轻微地混悬细胞。然后，用血细胞计数板计数细胞。
11. 用生长培养液稀释细胞悬液，以约 1.5×104 个/ml 的细胞密度将细胞接种于培养瓶。从 1 g 健康供体活检组织约获得 1~2×105个细胞。
12. 将 15 ml 消化液加入 P1，在 37°C 水浴中孵育组织块 30 min，并定时摇晃。
13. 用吸管吹打细胞悬液，使细胞分散。然后，用尼龙网过滤细胞悬液。用 20 ml 生长培养液浸洗滤网。
14. 离心（350 g，8~10 min）后，计数细胞，按上述方法接种细胞。
15. 将培养瓶移入湿润的培养箱，在 37°C 和 5 % CO2 的条件下培养细胞。
二、维持培养
16. 接种后 24 h 很轻微地换培养液，以后每 3~4 d 换液 1 次。细胞主要向着分化生长。人成肌细胞的生长分 3 期，培养后 4~6 d 增殖达髙峰；8 d 左右排列成行；10~12 d 细胞融合和形成肌管增多。然而，必须记住一些细胞可能分化较早，绝大多数细胞分化时一些细胞仍处于增殖状态。
三、传代培养
17. 将少量 EDTA 轻轻注在细胞上面后立即吸去。
18. 加入 0.25 % 胰蛋白酶液，足以在细胞上面形成一薄层。
19. 当细胞去附着时，加入 5~10 ml 完全生长培养液，用吸管很轻微地吹打细胞，然后离心（350 g，10 min）。
20. 计数细胞，按一定密度种植细胞。
注意事项
在扔入垃圾前，应该用次氯酸盐处理剩余组织和使用过的试管、吸管、培养皿等。
来源：丁香实验
