原代胚胎成纤维细胞培养

细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体内取出，在人工条件下培养，使细胞生存、生长、繁殖和传代，从而可以进行细胞生命过程、细胞癌变等问题的研究。由体内直接取出组织或细胞进行细胞培养叫做原代细胞培养，也有的把第1代细胞与传10代以内的细胞培养统称为原代细胞培养。一般来说，用幼嫩状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

原代鼠胚胎成纤维(MEF)细胞目前最大的用途是用来支持干细胞的培养。在培养鼠胚胎干细胞时，常常需要用分裂能力被抑制的原代鼠胚胎成纤维细胞作为辅助细胞来支持干细胞的生长并防止干细胞的分化。这些原代鼠胚胎成纤维细胞通常分裂两代后就停止分裂，所以需要经常制备新鲜的原代鼠胚胎成纤维细胞。

1. 将解剖用的剪刀、镊子和刀片进行无菌消毒。

2. 将怀孕小鼠用颈椎脱位法处死，将其固定在解剖板上。

3. 用70％乙醇喷洒在小鼠的腹部进行消毒，用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

4. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 mLPBS的50 mL离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS，将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其切碎至可用微量移液器吸取。

5. 用200μL的微量移液器反复快速吹打平皿中的液体，放在15 mL离心管中，

4℃ 1500 r／min离心5 min，倒掉上清液，加10 mL胰蛋白酶，重悬沉淀，37℃水浴中消化30 min，且每隔5 min轻轻晃动，使之充分消化。

6. 将上层细胞悬液倒入一装有10 mL DMEM培养基的50 mL离心管中，用200

目尼龙滤网过滤后，1 500 r／min离心5 min，弃去上清液。

7. 用移液管吸取30 mL DMEM培养基，让培养液沿离心管壁缓缓流入管底，

1 500 r／min离心5 min，弃掉上清液。重复一次此步骤。

8. 将细胞沉淀用15 mL培养基悬起。细胞计数(8只14天胎鼠可获得(2～3)×107个细胞)。

9. 将3×106个细胞悬浮于15 mL含10％小牛血清的DMEM培养基中，接种到

200 mL的培养瓶中。

10. 24 h后更换新鲜的含10％小牛血清的DMEM培养基。

11. 细胞长满后，弃掉培养基，用PBS小心冲洗，倒掉，加胰蛋白酶消化。

12. 轻轻晃动细胞培养瓶，见有细胞浮起，立即加入2 mL血清终止消化，用移液管把细胞轻轻悬起，混匀，使细胞成为单细胞悬液。

13. 1500 r／min离心5 min。弃掉上清液。加入10 mL含小牛血清的DMEM培养基，悬起细胞，按1：5传代。

14. 细胞再次长到覆盖率80％～90％，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。

15. 实验结果：可拍照存留。

1. 解剖小鼠时要注意无菌操作。

2. 用胰蛋白酶进行消化时，要随时观察，避免过度消化。