胚胎鼠成纤维细胞原代培养

细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体内取出，在人工条件下培养，使细胞生存、生长、繁殖和传代，从而可以进行细胞生命过程、细胞癌变等问题的研究。

细胞培养是指将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。包括原代培养和传代培养。

原代鼠胚胎成纤维(MEF)细胞培养是指从孕鼠中剖取适宜胎龄的胎鼠，采用酶消化法或或组织块贴壁法获得原代胚胎成纤维细胞。

1、用于支持干细胞的培养；

2、进行体外研究；

【材料】：

DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶（含EDTA）、青霉素-链霉素（双抗）、无菌PBS溶液、怀孕14-15天的母鼠、60mm无菌培养皿、100mm无菌培养皿、无菌离心管；

【主要仪器】：

倒置显微镜、二氧化碳细胞培养箱、4℃离心机、高压灭菌的手术器械（包括眼科剪、眼科镊等）。

1、取怀孕14-15的小鼠,采用脱颈椎的方法将小鼠处死,将小鼠浸泡在酒精中2-3nin；

2、暴露孕鼠腹部皮肤，用眼科剪将剪开腹壁以暴露出子宫角，取出子宫，将其子宫置于装有PBS（含双抗）的的培养皿中，用含有双抗的PBS冲洗3次（冰上操作）；

3、将取出的子宫转移至新的无菌培养皿中(装有预冷的PBS),用眼科剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠(冰上操作）；

4、将胎鼠移入新的含预冷的PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头部、四肢和内脏，得鼠胚躯干(冰上操作）；

5、 将鼠胚躯干转移至含预冷PBS的新的无菌培养皿中，用含双抗PBS洗涤至无肉眼可见的血色(冰上操作）；

6、将上一步获得组织移入另一含预冷DMEM]的培养皿中，剪碎至肉糜状，加入0.25%胰酶，置于37℃细胞培养箱消化15-20min；

7、15-20min后加入含血清的DEME培养基终止消化；

8、将200目筛网置于50ml离心上,将细胞悬液滴至筛网上过滤；

9、将获取滤液转移至15m离心管中,1000r，4℃离心5min；

10、弃上清，重新加入10%FBS的DMEM培养液，制成细胞悬液；

11、将悬液接种到预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中或培养皿，于37℃、5%CO2培养箱中孵育；

12、4-6小时后观察细胞贴壁情况，更换新鲜培养液；

1、剖取组织要在冰上操作；

2、冲洗组织时，用含双抗的PBS洗涤；

3、成纤维细胞易于贴壁，4小时就可以获得贴壁成纤维细胞；

1、细胞污染：注意操作过程严格无菌，子宫、胚胎冲洗时用含双抗的PBS；

2、获取细胞碎片较多：注意消化时间控制，切勿过度消化；

3、过200目细胞筛网时，悬液难以过滤：组织尽量减至肉糜状、胰酶使用前在37℃水浴锅充分预热；