原代培养中成纤维细胞的抑制

成纤维型细胞：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3 厘米个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。

培养细胞的纯化

【我是小米2】培养细胞的纯化：

1、自然纯化

即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增值潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。

2、人工纯化

（1）酶消化法

在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。

（2）机械划除法

原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。

（3）反复贴壁法

成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。

（4）克隆法

采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。

（5）培养及限定方法

某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞。

（6）流式分选

brdu

【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纤维细胞的生长，便宜易买到的

【snany】阿糖孢苷效果不是特别理想

【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的：成纤维细胞大量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞而抑制壁细胞生长，对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的生长，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培养液，时差贴壁30-45分钟，除去成纤维细胞，然后再换用无血清的培养液进行培养。不知道你有没有用？试试吧。

【sxtyzyq2】买sigma公司的brdu然后把它配成终浓度为1 mmol/l然后1ml培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞

【gfeng8078】我是养心肌原代，也需要抑制成纤维细胞，请问各位大侠，5-brdu用多大的浓度？

【cheerfulness】养心肌原代 最初24h培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的brdu

【gfeng8078】你是怎么样达到0.1mmol/L的浓度呀，由于有培养液的存在，加了Brdu进去，自然就稀释了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽滤，可是有报道说这对Brdu的药效有影响

【jiangbin1230】请问用组织块贴壁法能培养出肠的成纤维细胞吗？我试过很多次了，一个皿就只有零散的一二十个成纤维细胞，都是柱状上皮细胞，是否由于正常组织太少不能培养出啊？能帮帮忙吗？

【sdf771214】请问成纤维细胞的帖壁时间一般是多少?我养的是内皮细胞,如何时差帖壁啊?

【victoh】不同来源的成纤维细胞在不同培养支撑介质上的贴壁时间应该是不一样的，此外也还受到其他一些因素的影响，至于上皮细胞，其本身种类就更加复杂了

上皮细胞

【warmbull】我现在正在做的培养，但发现有几瓶细胞可能是被成纤维细胞（长梭形、透明细胞）污染了，后来成纤维细胞抑制了色素上皮细胞的生长。现在又出现了这种情况，请问各位大侠，有什么办法可以除去杂细胞？还有，我养的色素上皮细胞生长增殖很缓慢，有的甚至慢慢萎缩，会是什么原因呢？

【叶知秋】上皮细胞传代次数多后，其形态就类似成纤维细胞，你也可以爬片作细胞鉴定，了解有无污染情况。生长缓慢除提高血清浓度外，还可以增加换液次数，及时分瓶传代。

【yhdy2001】你可以试着用高糖培养基，这样细胞增殖快，目前国外和国内较大的细胞研究所普遍采用高糖培养基；另外，做原代时取材很关键，尽量避免筋膜等组织的污染

【pigpig】曾经看过一篇论著，具体名字记不清了，里面从分子和蛋白水平论证了视网膜色素上皮细胞传代4代以后基本没有RPE原有性质特征，只具有成纤维细胞的特征。

【qkk1229】同意N代后就是成纤维细胞的模样，很多细胞体外培养到后来，都长的象成纤维细胞，不知道为什么，有人知道吗？

【jamesxia】去除成纤维细胞

1、反复贴壁法（差速贴壁法）：倒去旧培养液，用Hank′s液洗3次，然后加入消化液（0.2%EDTA+0.25%胰蛋白酶），37℃10min，镜下可见成纤维细胞成圆形，癌细胞维持原状。吸出消化液，加Hank′s液吹打细胞使成纤维细胞脱落，吸出旧液，组织块和癌细胞团用Hank′s液轻轻漂洗3次。加入培养液CO2孵箱，37℃，每周换液1次，处理1次。

2、血清浓度，上皮细胞耐受低血清环境的能力较强，而成纤维细胞的耐受力较差，利用这个差异，用含1.5%血清的培养液可以降低培养物中成纤维细胞的生长。

垂体细胞

【ccyy30】我在胚胎大鼠腺垂体细胞的原代培养中发现有好多的成纤维细胞和神经细胞，如何纯化【luoyangu】原代培养中要除去较多的成纤维细胞，在接种细胞于膜插片前，按1～５１０的５次方个／ml的细胞密度接种到大约5ml 单个细胞悬液到２５立方厘米培养瓶中，原代培养２天后，不经胰酶消化，通过吹打收获漂浮的细胞和被分散的细胞，离心（１５００转／分，１０分钟），再用培养液将细胞沉淀重新悬浮成细胞悬液，然后接种在膜插片上，这样可以除去黏附的成纤维细胞而保留要的细胞．

【ccyy30】这种方法是否就是差速贴壁法，膜插片指的是多聚赖氨酸包被培养板吗

星形胶质细胞

【gaowei98755】 我养过星形胶质细胞，我感觉想避免成纤维细胞的污染，需要注意两方面：1，取材时一定要将脑膜、血管等结构彻底除去，宁可少留些脑组织，也要将杂质（权且这样说，即其他结缔组织）去除干净。2，差速贴壁法，可以将细胞先差速贴壁20~30分钟，将成纤维细胞去除，然后再将细胞悬液接种到其他瓶中，培养。这两种方法可以联合使用，也可以只用第一种方法即可

心肌细胞

【gmwang1991】心肌细胞本来就是不容易贴壁的细胞，在除去心肌细胞中混杂的成纤维细胞和内皮细胞就是利用成纤维细胞和内皮细胞贴壁快而心肌细胞贴壁慢的原理进行换皿法来纯化心肌细胞的。换皿后最好48小时内对你所培养的心肌细胞不进行任何处理，包括观察，这样应该没有问题了。如果还是不能够贴壁的话，你可以考虑一下用塑料瓶，或者对培养用的玻璃瓶进行如下处理：在培养前进行鼠尾胶原包被或者硝酸蚀刻或者纤粘连蛋白包被，在这方面有许多文献报道的，你只需要注意看都会有解决办法的。

【猫耳朵】乳鼠心肌细胞培养

尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。

【windboy77】乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞，培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法，我们在试验中摸索到0.06％浓度的胰酶对细胞损害较小，比起一些文献记载的0.15％浓度有一定的优越性，但这个浓度消化所需时间较长，所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同, 采用差速贴壁1 h, 除去成纤维细胞，达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。很好和心肌细胞鉴别。

胰岛细胞

【genobody】大鼠胰岛细胞原代培养

一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞，

【wangtsy】胰岛的分离与纯化

取新生1-3天SD大鼠10-15只，无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中，用眼科剪去除非胰腺组织， 4℃ Hanks液清洗三次后，用眼科剪反复剪切至<0.5mm3组织块，取浓度为1g/L的V型胶原酶溶液5-10ml与之混合,转入三角烧瓶中，于37℃恒温水浴振荡器消化30-40min， 加入两倍体积4℃Hanks液终止消化，用吸管反复吹吸后过80目 筛网，滤液以800rpm低速离心70s去上清液，并用4℃ Hank's液低速离心清洗2次，除去单个腺泡及上皮细胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640完全培养基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100mg/L链霉素、71.5umol/L β-巯基乙醇）中制成细胞悬液,接种于75ml玻璃培养瓶中,于37℃,5%CO2,95%空气条件下培养5h后，用无血清培养基低速离心清洗3次,以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h，转瓶弃去贴壁细胞，用无血清培养液低速离心洗涤两次，沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMI1640完全培养基养吧，可长成胰岛单层细胞。

内皮细胞

【benn】看到园子里有好多同仁培养大鼠主动脉内皮细胞,我也在做内皮细胞培养,现在看到一种新的大鼠主动脉内皮细胞的培养方法,正在摸索中,说出来与大家讨论.

材料与方法：

材料 :

1.培养皿、培养瓶、烧瓶、试管，玻璃针等。

2.眼科剪、眼科镊、手术刀片。

3.5%CO2孵箱、PH计。

4.恒温水浴箱。

5.RPMi1640培养基，D-Hank’s缓冲液 、胎牛血清，内皮生长因子（ECGF），青霉素，链霉素,戊巴比妥钠等。

方法：

1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠, 大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。

2.剪切：在超净台上，将血管置于培养皿中,用眼科镊小心剥离外膜面的结缔组织,并从根部剪去所有肋间动脉。无血清培养基冲洗数遍,去除残血后,将动脉转移至另一含少量培基的无菌培养皿中，用刀片将主动脉两末端切去,剩下的主动脉切成宽1～1.5ｍｍ的环。

3.接种：将动脉环竖直放入35ｍｍ培养皿(1%明胶4℃预置过夜,用前2ｈ移入ＣＯ2培养箱,用前培养液冲洗)中。置ＣＯ2培养箱2ｈ后,加入1.5ｍl培养基。放入37℃,5%ＣＯ2培养箱中培养。72ｈ后细胞从环内外生长迁出,环内为内皮细胞,环外为成纤维细胞。将动脉环除去后,可看到内膜面细胞集落与外膜面之间有明显的无细胞区界限，用玻璃针剔除成纤维细胞,得到纯的内皮细胞生长克隆。继续培养10～15ｄ，此时FBS浓度为２０％,形成细胞单层。

4.置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液，培养时添加15% FBS，5～10μg/ml的内皮细胞生长因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。待细胞90%~95%融合时，0.25胰蛋白酶消化传代。

5.内皮细胞鉴定：相差显微镜下,细胞呈单层铺路石状;免疫组化证明有vWF相关抗原存在

6.注意事项:将分离出来的主动脉热处理时温度以60℃2秒为宜,太低则成纤维细胞多,太高或时间久则内皮细胞迁出减少.

【tomandmikes】如果原代培养后，脐静脉内皮细胞和成纤维细胞并存，如何消除后者？尽管通过消化时间的调整可以避免成纤维细胞的存在，但是消化时间过短，收集的细胞数量较少，过长又会增加成纤维细胞污染的机会。

然而一旦污染之后，如何分离纯化内皮细胞呢？有文献报道，可以用消化法，根据消化时间的不同，来筛选内皮细胞，我一知半解，还请高手进来指教。

【Goodluck_XD】Simple, fast and efficient mouse endothelial cell isolation with Dynabeads. Isolated cells are pure and free of contaminating fibroblasts

Introduction

Endothelial cells line the entire vascular system, from the heart to the smallest capillary and control the passage of materials and the transit of leucocytes into and out of the bloodstream. Leucocytes interact with endothelial cells during trafficking, immune responses, inflammatory reactions and haemostasis. A pure population of cells, free from contaminating fibroblasts is required to study endothelial cells. Murine tissue is digested to obtain a single cell suspension. Dynabeads coated with an anti-murine endothelial cell antibody are added directly to the cell suspension and the bead-captured cells are separated with a magnet, Dynal MPC.

1.Endothelial cell isolation from murine tissues

A rapid, reproducible method for the isolation of murine tissue endothelial cells (EC) has been developed by Dong et al (1) using Dynabeads M-450 Sheep anti-Rat IgG coupled with a monoclonal rat anti-mouse CD31 antibody. After releasing the beads with trypsin/EDTA, the released cells were centrifuged and resuspended in growth medium for cell culture and further cloning.

Of 300 cells plated, 29 clones were obtained after two weeks and all clones were positive for CD31. To evaluate the specificity and recovery efficiency of this method, the CD31+ murine endothelial cell line H5V was mixed with a melanoma cell line and/or mixed with L929 fibroblasts. In both cases the percentage of isolated cells was > 98% and the recovery was 65% of the original CD31+ murine endothelial cells.

2.Primary mouse lung endothelial cell isolation from cultures

Hartwell et al (2) used lung tissue as plated cells. Dynabeads M-450 Sheep anti-Rat IgG were coated with rat anti-mouse intercellular adhesion molecule-2 IgG and added to the plated cells. After incubation, the cells were trypsinized to release all cells before isolation with the Dynabeads. Endothelial cells were stained for P-selectin, an adhesion receptor for leucocytes.

3.Pure fibroblast and endothelial cell colony cultures from murine bone marrow

The adherent stromal cells of bone marrow consist of endothelial cells, fibroblasts and macrophages. Endothelial cells and macrophages are phagocytic but fibroblasts are not. These differences can be used to isolate the different cell populations. Fei et al (3) used magnetic separation to obtain cultures of EC and fibroblasts (3). Bone marrow cells were cultured and non-adherent cells poured off. The adherent cells were subsequently used in two ways:

i) To obtain endothelial cells, adherent cells were released from the culture plates with trypsin and Dynabeads M-450 Epoxy were added at the ratio 3 beads to 1 cell and incubated for 2 hours at 37°C. At this temperature, phagocytic cells in culture engulf the beads. The bead-captured cells were collected with the magnet and non-phagocytic fibroblasts discarded. The bead/cell complexes were then cultured in low concentration for 10 days to reduce macrophage growth. Endothelial cell clones (> 20 cells) were then picked and cultured again to confluent growth.

ii) To achieve pure fibroblasts more magnetic beads were used. A 40 bead to 1 cell ratio was added to trypsinized adherent cells to ensure all phagocytic cells (endothelial cells and macrophages) engulf beads. The bead-captured cells were collected and the non-phagocytic fibroblasts were collected and cultured. The fibroblasts were re-passaged to ensure there were no contaminating cells and then grown to confluence.

1.Q. G. Dong, et al., A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues -Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 1997; 17:1599-1604.

2.D. W. Hartwell, et al., Role of P-selectin cytoplasmic domain in granular targeting in vivo and in early inflammatory responses. Journal of Cell Biology 1998; 143 4:1129-1141.

3.R-G. Fei, et al., A method to establish pure fibroblast and endothelial cell colony cultures from murine bone marrow. Exp.Hematol. 1990, 18:953-957.

【zhaoqingshan】Goodluck_XD 斑竹的解决方案可能比较费银子。

我也曾遇到过类似的问题，一般来说，原代的时候一定要尽可能的纯，宁可错杀一千，不可放过一个成纤维细胞，否则传代后细胞就会比较杂。所以原代不够纯就放弃。另外，给足生长因子让内皮充分的生长起来。

以前一个老师提供过采用胶原酶的方法，差速消化，不知道是否有效，楼主可以试试，有结果告诉我。另外，有些差速贴壁的方法，好像并不合适，因为内皮贴壁也很快的。

我也是听说的，并不可靠啊，您最好试验一下，就是用0.1%I型或II型胶原酶消化，试试，据说成纤维细胞会先掉下来。要是有结果，一定要告诉我啊！呵呵！

说实话，我养过好几种内皮，就是没有正儿八经的养过HUVEC，帮别人养过几次，纯度还可以(其实消化得好的话，不存在杂细胞的问题的，传2-3代进行实验没有问题的)，就是传不了几代。

【tomandmikes】是啊，纯度的问题好说，可以摸索控制时间，但是要不加生长因子等刺激物，仅用培养基和血清，很难多次传代。其实消化后的成纤维细胞不是很多，但见了很烦，我且试试你说的方法。不知道用胰酶可以不可以？

【zhaoqingshan】应该是不可以的，我试过，换低浓度的胰酶也不可以的。内皮和成纤维被消化下来的时间差不多。用ECGF 20ug/ml也不是很贵的，我倒觉得胎牛太贵了。因为我以前养脑微血管内皮用ECGF 150ug/ml。

混合星形细胞

【midas】混合星形细胞的培养

1、取材:取新生4天SD大鼠，颈动脉放血，无菌操作取出 脑组织，切除脑干和海马，解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管等结 缔组织。

2、机械分散:取大脑皮质转移至试管中，并将其快速剪成 1 mm3 左右小块，加适量培养液，用吸管轻轻吹打，使细胞分散，制成细 胞悬液，再经74 um网筛过滤，取滤液，离心，1500r/min, Smin, 重悬细胞，进行细胞计数。

3、细胞计数:台盼蓝:细胞悬液=1: 9染色，在显微镜下计 数。

4、接种与培养:调整细胞密度，以1 X 105/cm`的密度接种于 预先涂有多聚赖氨酸(poly-L-lysine, PLL)的培养瓶中，于培养 箱中孵育30min,翻转瓶并吸出细胞悬液再接种于培养瓶中，以除去成纤维细胞。370C, 5% C0.2培养，每3天换液一次，培养10天。倒置相差显微镜下观察细胞形态细胞，见细胞分为两层:下层是 TIA，上层是0-2A祖细胞。

人胚嗅鞘细胞

【lvranbo1010】 人胚嗅鞘细胞的原代培养

将胚胎头部剪下，浸泡在75％的酒精内3分钟，大量D-Hanks平衡盐溶液冲洗。手术显微镜下，超净台内，迅速完整取出两侧嗅球,置于4℃的D-Hanks平衡盐溶液中，小心除去软脑膜,血管及与其相连的组织。然后用显微器械剪取嗅球最外两层(嗅神经层和小球层,ONGL),再用D-Hanks平衡盐溶液洗3遍。置于含3－4ml DMEM/F12培养基的35mm2培养皿内，将剪取的ONGL组织块用显微器械小心撕开，再用火焰抛光后的移液管小心反复吹打至尽可能小（勿使培养基产生过多的气泡），放入CO2培养箱(5%CO2,37℃)中培养。

人胚嗅鞘细胞的纯化

取材于人胚嗅球的嗅鞘细胞在培养过程中有多种其他细胞，如来自血管、软脑膜等结缔组织的成纤维细胞,以及神经元、星状胶质细胞、小胶质细胞等。其中，成纤维细胞是嗅鞘细胞培养体系中最棘手的污染细胞,其分裂增殖和贴壁速度极快,远远超出嗅鞘细胞的分裂增殖和贴壁速度,且侵蚀面积大。这个特点与动物相似。用于动物嗅鞘细胞纯化的方法很多，有差速贴壁、化学药物法、梯度离心法、免疫亲和吸附法等。目前国内外大多采用阿糖胞苷来达到纯化的目的。但我们参考动物嗅鞘细胞的纯化方法，在不同时间加入1×10－6－1×10－9浓度的阿糖胞苷，每数量级分别培养10次。我们发现，与动物嗅鞘细胞培养过程中阿糖胞苷纯化效果较好相比，人胚的嗅鞘细胞用阿糖胞苷纯化效果极不理想，且嗅鞘细胞数目大大减少。故试验中，我们放弃了阿糖胞苷纯化的方法，而采用了差速贴壁＋免疫亲和吸附的纯化方法。根据胎龄的不同，把含有嗅鞘细胞的培养基在CO2培养箱(5%CO2,37℃)中培养12－24小时。培养过程中，每2小时相差显微镜下观察一次。如观察到较多的立体感较强的细胞开始贴壁时，立刻将含有未贴壁的细胞的培养基接种到预先用Ｐ75抗体包被的35mm2培养皿内，放入CO2培养箱(5%CO2,37℃)中继续培养。培养36－48小时换液, 祛除未能和Ｐ75 抗体结合的细胞。

人胚嗅鞘细胞的免疫细胞化学染色及免疫荧光染色及嗅鞘细胞纯度检测

用于嗅鞘细胞免疫染色的抗体较多[1]，有胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，p75 NTR等，因本培养皿预先用p75抗体包被，故选用GFAP（1：1500）抗体进行免疫染色。成纤维细胞不能为GFAP抗体所标记，而嗅鞘细胞对GFAP标记较敏感且染色均一。所以GFAP免疫组化法可用于鉴别嗅鞘细胞和成纤维细胞。GFAP免疫组化法的缺点是不能区别OECs与其他中枢神经胶质细胞如小胶质细胞等,但前者从形态上（嗅鞘细胞的细胞有一个甚至多个突起，且突起十分细长）很容易与这些细胞区别出来。将培养好的嗅鞘细胞继续培养13d,分别在培养1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d弃掉上清,用0 .01MPBS清洗3次,接着用4%多聚甲醛固定30分钟,再用PBS清洗3次,0.3％双氧水处理10min,0.01MPBS清洗3次， Triton x-100洗30分钟，0.01MPBS清洗3次。滴加正常山羊的血清封闭液封闭20分钟后，甩去多余液体，不洗，加胶质纤维酸性蛋白(GFAP)羊抗血清,按ABC法进行免疫细胞化染色,同时进行免疫荧光染色，并设立空白对照和替代对照。将染色的细胞分别置于OLYMPUS倒置相差显微镜和OLYMPUS荧光显微镜观察, 计数嗅鞘细胞的百分率。

免疫组织化学反应显示：带细长突起的单极、双极或多极的梭形细胞抗－GFAP，抗－nestin均阳性，可以确定这些细胞为嗅鞘细胞。成纤维细胞为GFAP反应阴性,神经元也呈GFAP阴性反应。虽然星状胶质细胞也为GFAP反应阳性,但从形态上容易区分两种胶质细胞（见图E－F）。 

在治疗中枢神经系统损伤，需要大量的纯度较高的嗅鞘细胞，这是移植是否成功的基础。我们认为，由于成纤维细胞的生长速度大大快于嗅鞘细胞，所以，通过差速贴壁的方法，可以祛除大部分的成纤维细胞，而免疫吸附可以使绝大部分的嗅鞘细胞贴壁，免疫吸附后培养36－48小时换液,能祛除未能和Ｐ75结合的其他细胞。如：神经元、星状胶质细胞、小胶质细胞。此时获得的嗅鞘细胞是纯度比较高的。虽然近期文献报道[2]，一定数量的其它细胞，可促进嗅鞘细胞的作用。但这尚需进一步的研究。

在动物嗅鞘细胞培养的实验中，国内及大部分国外实验室都通过加入阿糖胞苷来达到祛除成纤维细胞的目的。但我们实验室通过分析不同时间点加入1×10－6－1×10－9浓度的阿糖胞苷培养结果，我们认为加入阿糖胞苷虽然可在短期内有效抑制成纤维细胞生长，但同时也抑制了嗅鞘细胞的生长，且在撤除阿糖胞苷很长时间后，嗅鞘细胞仍不能明显增殖。同时有可能残存的成纤维细胞由于失去了嗅鞘细胞高密度抑制从而迅速增生，使嗅鞘细胞纯度迅速下降。

p75是神经营养因子低亲和力受体,在嗅鞘细胞膜表面由跨膜、细胞外和胞质等三部分组成,其抗体能和细胞外部分发生特异性结合。因此,包被在培养皿上的p75抗体可以通过抗原抗体反应,在较短时间内将表达p75的嗅鞘细胞吸附在培养皿表面。而其它污染细胞由于缺乏p75，所以贴壁较慢。

人胚的嗅鞘细胞接种后，胎龄越小，贴壁所需时间越短。在有无血清的培养基中培养时，形态无明显差异。人胚的嗅鞘细胞较动物嗅鞘细胞生长快，且体积与突起长度均较动物的嗅鞘细胞大。因此，我们可以认为不同种属的嗅鞘细胞是有差异的。虽然表达有同样的物质，但也可能表达不同的物质。所有这些需要进一步研究。这对于最终的临床应用有着重大意义。

间充质干细胞

【flyingpumc】兔骨髓间充质干细胞的培养方法

兔骨髓间充质干细胞的提取、分离:取日本大耳兔10 只,4 个月龄,体重215～310kg。用2 %利多卡因于手术部位施以局部麻醉,在无菌操作下以骨髓穿刺针刺入兔髂骨骨髓腔,接5ml注射器,内含3000U/ ml 的肝素0.2ml ,抽出骨髓4～6ml ,经低糖的DMEM 稀释后,与Percoll 液( Pharmacia ,比重1.073g/ ml) 按1∶1 的比例进行梯度离心,928g 离心20min。离心后缓慢吸取中间交界面乳白色云雾状悬浮细胞至另一试管,以低糖的DMEM 洗涤两次,悬浮。

将上述分离所得单核骨髓细胞按2.0 ×105/ cm2接种于含有10 %胎牛血清(FBS) 的HG2DMEM(含有青霉素100μg/ ml 、链霉素100μg/ ml ,pH7.2) 的聚苯乙烯一次性培养瓶内,于37 ℃,5 %CO2 ,100 %饱和湿度条件下进行细胞箱培养。于72h 后除去非贴壁细胞,同时更换新鲜的培养液,以后每隔1 天更换新鲜的培养液,用倒置相差显微镜观察细胞形态及其生长变化并摄像,待细胞生长铺满至瓶底约90 %以上融合时,用0.25 %胰蛋白酶和0.01 %EDTA 消化贴壁细胞,取原代MSCs 进行相关的检测,同时按同样的密度进行传代。

兔骨髓间充质干细胞的传达培养:将传代的第P1 代、第P4 代、第P8 代间充质干细胞,按每孔2 ×105个定量接种于24 孔培养板,次日起,每天取3 孔的细胞,经0.25 %胰蛋白酶消化后,作细胞计数,直至基本铺满整个瓶底。按3 孔细胞均数取点,绘制其生长曲线。传代培养过程中,隔日换液。

实验研究用Percoll (密度为1.073g/ ml) 梯度离心法加贴壁培养方法提取MSCs 既是简便的,又是实用的,与Ficoll (密度为1.077g/ ml) 梯度离心法相比,其比重较轻,能够在梯度离心时利用MSCs 与成纤维细胞比重不同,将MSCs 与成纤维细胞分离开;单层贴壁培养法又将不能贴壁的造血细胞分离开。

肝细胞

【yangqingdoctor】从胎鼠肝中获得的细胞培养后发现成纤维细胞特别多，而肝细胞较少，请问有什么办法可以很好的去除成纤维细胞，percoll离心可以吗，具体怎样？

细胞传代时，用胰酶消化,细胞变化不大,还是贴壁,请问为什么,怎样处理?

【huangxianzi】

1、试试看肝细胞专用培养基，如Gibco的Hepato－ZYME,可有效去除杂细胞。

2、还可试试梯度贴壁法，因成纤维细胞贴壁比肝细胞快，因此培养1小时后，换瓶，再重复一次，看看有无效果，但操作过程中，注意温柔一些，因肝细胞在体外很难培养。

liubo4210482sin培养平滑肌细胞中,出现了很多的成纤维细胞,请问有什么好的办法可以分离出它们???

有人说.用胰酶消化以后,两种细胞贴壁有快慢:成纤维细胞贴壁快,平滑肌细胞贴壁慢,靠掌握时间将它们分离开.

上面的说法是否正确,那么消化后,(细胞贴壁过程中)该在多少小时以后将悬浮液转移,另外培养,才能得到比较纯的平滑肌细胞???

shawm

多准备几个培养皿，消化重悬后，你随时观察细胞，过一段时间取上清，转入另一个培养皿。可以反复多次转皿。你的平滑肌细胞在上清中，所以可以时间稍长一点，但别等到大部分细胞贴壁。

chaoyuan

1、差速贴壁法。成纤维细胞贴壁快,平滑肌细胞贴壁慢。

2、加入5-溴-2′-脱氧尿苷（5-Brdu）,终浓度为0.1 mM ，抑制成纤维细胞生长。