原代胚胎成纤维细胞培养

一、实验器材：

手术小直剪刀三把、眼科直镊子三把、眼科弯镊子两把、玻璃平 皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、实验试剂：

无Ca+2和Mg+2的PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纤维细胞（MEF）生长培养基:高糖DMEM加10%FCS。

三、实验动物：

孕期14至16天的孕鼠

四、实验步骤：

1、处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2、用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30MLPBS的50ML离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其细细切碎。

3、用200ul的移液枪反复快速吹打平皿中的液体，放在15ML离心管中，4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，加10ML胰酶，重悬沉淀，放37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4、将上层细胞悬液倒入一装有10MLMEF生长培养基的50ML离心管中，用200目尼龙滤网过滤后，1500rpm离心5分钟收集细胞。30ML　MEF生长培养基洗涤两次（此步骤中作者试过用无血清的培养基洗涤，结果无差别）。

5、细胞沉淀用15ML生长培养基悬起，细胞计数（八只14天胎鼠可获得2-3×107细胞）。

6、3×106细胞悬浮于15ML MEF生长培养基中，接种到200ML的培养瓶中。

7、24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8、细胞长满后，先用PBS冲洗，倒掉，加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟），按1：5传代。

9、细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存。（冻存液要现配）

五、讨论：

1、原代培养，一定要避免污染。

2、MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。

3、冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。

4、消化细胞时间不要过长。