小鼠胚胎成纤维细胞的原代分离与冻存

小鼠胚胎成纤维细胞是胚胎干细胞体外培养时最理想的饲养层，用于小鼠、人来源胚胎干细胞培养，也广泛用于诱导多潜能干细胞（iPS）培养的饲养层细胞。

将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用 EDTA）处理，分散成单细胞，置 MEF 生长培养基中培养，使细胞生存、生长和繁殖。

器材：

① 无菌的手术器械，一次性无菌培养皿，一次性无菌移液管；

② 能提供 8 000 rads 射线的照射源；

③ T75 培养瓶；

④ 15 ml、50 ml 离心管，注射器和针头，1.5 ml 冻存管；

⑤ 涂有明胶的 6 孔板

试剂：

① 胰蛋白酶；

② 75％ 乙醇；

③ 麻醉剂；

④ EDTA-Na2、DMSO；

⑤ 明胶粉剂；

⑥ PBS；

⑦ 胎牛血清；

⑧ MEF-I 培养基、DMEM 培养基；

⑨ 非必需氨基酸；

⑩ 100x 青霉素-链霉素

（一）试剂配制

（1）麻醉剂：2.5％ Avertin 配制； 三溴乙醇（tribromoethanol），10 g；叔戊醇（tertiaryamyl alcohol)，10 ml；PBS，390 ml。混匀后，4 ℃ 避光保存。

（2）0.05％ 胰蛋白酶的配制：PBS，100 ml；胰蛋白酶，0.05 g；EDTA-Na2，0.004 g。待胰蛋白酶和 EDTA 充分溶解后，用 0.22 μm 滤器过滤除菌，-20 ℃ 保存，保持无菌。

（3）0.1％ 明胶溶液的配制：PBS，100 ml；明胶粉剂，0.1 g。高压灭菌。4 ℃ 保存，1 个月内使用。

（4）MEF 培养基的配制：MEF-I 培养基（MEF 原代分离时使用）。DMEM 培养基，900 ml；胎牛血清（56 ℃ 热灭活 30 min），100 ml；非必需氨基酸，10 ml；100x 青霉素-链霉素溶液，10 ml。将所有组分混合后，用 0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃ 保存，保持无菌。

（5）MEF-C 培养基（MEF 培养时使用）：DMEM 培养基，450 ml；胎牛血清（56 ℃ 热灭活 30 min），50 ml；200 mmol/L L-谷胺（使用前冷冻保存），5 ml；非必需氨基酸，5 ml。将所有组分混合后，用 0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃ 保存，保持无菌。

（6）冻存液的配制：DMEM 培养基，60 ml；DMSO，20 ml；胎牛血清（56 ℃ 热灭活 30 min），20 ml。将所有组分混合后，用 0.22 μm 滤器过滤除菌。

（二）开始前准备

（1）孕鼠，ICR 系，孕 13~14 d。

（2）提前 20 min，将 PBS 预温到 37 ℃，每只孕鼠准备 100 ml。

（三）原代 MEF 细胞的分离

（1）给每只孕鼠腹腔注射 0.5 ml Avertin，待小鼠麻醉后，进行断颈处死。

（2）放入盛有 75％ 乙醇中浸泡 2~5 min 消毒。

（3）用无菌剪刀镊子剪开孕鼠腹腔皮肤，暴露腹腔，注意不要剪开腹膜。

（4）换一副无菌的剪刀镊子剪开腹腔取出子宫，放在预先准备好的无菌平皿中。处理掉孕鼠的尸体。

（5）用吸管将子宫用 10 ml PBS 冲洗三遍。

（6）用眼科剪和眼科镊切开囊胚，将胚胎游离。

（7）将胚胎入新的无菌培养皿中，用 10 ml PBS 洗三遍。

（8）计数分离得到的胚胎数。

（9）去除胚胎的头、尾、四肢及内脏组织。注意：内脏组织颜色较深。

（10）将胚胎放入新的养皿中用 10 ml PBS 洗三遍。

（11）吸去多余的 PBS。

（12）使用弯头眼科剪将组织剪成小颗粒。注意：大约用 6~10 min 剪切组织。剪碎时，用一个手顶住培养皿，与桌面保持小角度，使组织集中在培养皿的一侧，提高剪切的效率。

（13）加 2 ml 胰蛋白酶，继续剪切几分钟，使组织颗粒更小。

（14）再补加 5 ml 胰蛋白酶，用吸管充分将组织和胰蛋白酶混匀，将培养皿 37 ℃ 孵育 20~30 min，中间可取出用无菌 25 ml 吸管反复吹吸几次。

（15）消化结束，加大约 20 ml MEF-I 培养基，用 10 ml 移液管把黏性物质混匀，使黏性物质基本分散，吸取上面的细胞悬液。剩余团块不能再用胰蛋白酶消化，否则细胞活力下降。

（16）用 200 目的筛网过滤，注意别让黏性物质堵塞网孔。

（17）过滤后，将组织消化液转移入 50 ml 离心管中，200 g 离心 5 min。

（18）去上清液，用 MEF-C 培养基重悬，分装入 T75 培养瓶或 10 cm 培养皿中培养，每个瓶或皿原代培养大约 10 个胚胎消化得到的细胞。

（19）培养过夜，显微镜下观察，如细胞汇合已超过 90％，可直接进行收集和冻存；如细胞汇合还不足 90％，继续培养一天。

（20）吸去多余的培养基，加入新鲜 MEF-C 培养基 10 ml。

（21）培养细胞直至培养瓶中细胞汇合超过 90％。注意：细胞中可能会混有部分组织块。

（四）MEF 的消化冻存

（1）收集 MEF 细胞，培养的细胞去除培养基后，用 PBS 洗一遍。

（2）加入 3~4 ml 胰蛋白酶，以能覆盖整个培养瓶（皿）底为宜，孵育 5 min。

（3）掌拍培养瓶（皿）3~5 次，直至细胞从培养瓶表面脱离。注意：掌拍前要确保培养瓶盖是拧紧的。

（4）每个 T75 培养瓶加 5 ml MEF-C 培养基，与胰蛋白酶混合，中止胰蛋白酶活性。用 10 ml 移液管反复吹打，使细胞团完全散开。注意：不要产生气泡。

（5）将培养瓶内的细胞悬液收集到 50 ml 离心管，弃去较大的组织块。可以将细胞悬液重新转移到一个新的 50 ml 离心管内，弃去多余的组织块。

（6）细胞悬液 200 g 离心 5 min。

（7）弃去上清液，将细胞团拍松散后用新鲜的 MEF-C 培养基重悬。一般一个 T75 培养瓶冻 3 支，重悬时每个 T75 培养瓶的细胞加 1.5 ml MEF-C 培养基。

（8）逐滴加入等量的冻存液，混匀。

（9）迅速将 1 ml 细胞悬液装入 1.5 ml 冻存管。盖紧后放入异丙醇冻存盒中。

（10）立即转入 -80 ℃ 冰箱，保存过夜。

（11）次日将冻存的细胞转入液氮罐保存。

（1）操作过程中始终注意无菌概念：取胚胎的时候，酒精灯一定放在旁边。

（2）剪胚胎时，要充分点，不能有大的组织块。

（3）去内脏和血块要彻底，血液会影响胰蛋白酶消化。

（4）消化时间要控制好，不宜太长，时间越长团块越黏，细胞不容易被离出。

（5）吹打黏性物质一定要轻轻的，不能太猛烈，否则影响细胞活力，团块更吹不散。

（6）黏性物如果真吹不散，可以先过滤上层液，再用 30 ml 或 50 ml 的针筒，轻轻地吹 2~3 次，切勿用力吹，以免细胞死亡，再换滤网过滤，同时用培养液冲洗。

（7）一般 MEF 培养 1~2 代冻存备用。

（8）照射处理后的 MEF 尽快使用，一般不使用超过 5 d 的饲养层细胞。

（9）明胶溶液配制时，明胶不易溶于 PBS，高温灭菌后能充分溶解，呈透明液体。

（10）冻存液最好现用现配。

（11）剪碎组织后胰蛋白酶在孵育过程中，可以从第一步开始对另一只小鼠进行处理和制备，以提高时间利用率。