MEF小鼠胚胎成纤维细胞富集/消化/传代知识总结

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小鼠胚胎成纤维细胞的富集

1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。

2、用70%乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS 洗三遍。

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏(所有深色的东西)。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA 继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1-4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。

8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。

10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。

12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。

注释：

我们已用CF-1品系的鼠制备了成纤维细胞。

培养基成分：

88% DMEM

10% FBS

1% NEAA

1% 双抗

对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。

小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代

1、移去MEF培养基

2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞(以去除胰蛋白酶的抑制物)。

3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA(0.05%的胰蛋白酶)，消化5min。

4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。

6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。

7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。

8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。

注释：

MEF培养基成分：

89% DMEM (Gibco # 12100-046)

10% FBS (Gibco # 16000-044)

1% NEAA (Gibco # 11140-050)

MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代(第4代或第5代)比例应该是1:2。