消化法传代培养

消化法传代培养是适用于大多数贴壁细胞的传代培养方法。

消化法传代培养的基本原理是利用一些消化剂（常为 0.25％ 胰蛋白酶液）首先使贴壁细胞与培养器皿表面及其他细胞间发生分离，然后进行稀释、再培养以获得传代细胞。

器材：

原代培养的肝细胞（70％~80％ 融合）

25 mL 培养瓶、吸管、 胶帽、离心管

酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜

超净工作台、CO₂ 培养箱

试剂：

D-Hanks 液

DMEM 培养基（含 10％ 小牛血清）

0.25％ 胰蛋白酶消化液

消化法传代培养基本过程可分为以下几步：

A. 用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。

B. 向瓶内加入适量的 D-Hanks 液，轻轻摇动后倒掉。

C. 加入消化液，消化液的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇动培养瓶，在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、胞间间隙增大时，迅速将消化液吸出。

D. 加入 D-Hanks 液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出，加入含血清的培养液终止消化。

E. 用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。

F. 将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打。

G. 收集细胞悬液于离心管中，1000 r/min 离心 3~5 min，去除上清。

H. 细胞计数，按照 1 x 10⁵~1 x 10⁶ 个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。

1. 在用胰蛋白酶液对细胞加以消化时，需用不含 Ca^2＋ 和 Mg^2＋ 的 D-Hanks 液清洗培养细胞表面残留的培养液，以避免其所含的血清对胰蛋白酶活性的抑制。

2. 消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消化时间。当胞质回缩、细胞间的连接变松散等情况出现时，应终止消化。因上皮样细胞彼此间连接较为紧密，其消化的时间通常比成纤维样细胞长。此外，首次传代的细胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。

3. 首次传代的细胞因需适应新的环境，可适当增加其接种量，以促进其生存与增殖。

传代培养的过程通常较长，细胞被污染的可能增加，因此，必须严格进行无菌操作。