简介
小鼠胚胎成纤维细胞是胚胎干细胞体外培养时最理想的饲养层，用于小鼠、人来源胚胎干细胞培养，也广泛诱导多潜能干细胞（iPS）培养的饲养层细胞。
原理
小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养原理是将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用 EDTA）处理，分散成单细胞，置 MEF 生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
材料与仪器
器材：
① 无菌的手术器械，一次性无菌培养皿，一次性无菌移液管
② 能提供 8000 rads 射线的照射源
③ T75 培养瓶
④ 15 ml、50 ml 离心管，注射器和针头，1.5 ml 冻存管
⑤ 涂有明胶的 6 孔板
试剂：
① 胰蛋白酶
② 75％ 乙醇
③ 麻醉剂
④ EDTA-Na2、DMSO
⑤ 明胶粉剂
⑥ PBS
⑦ 胎牛血清
⑧ MEF-I 培养基、DMEM 培养基
⑨ 非必需氨基酸
⑩ 100x 青霉素-链霉素
步骤
小鼠胚胎成纤维细胞的复苏和饲养层制备的基本过程可分为如下几步：
（一）试剂配制
（1）麻醉剂 2.5％ Avertin 配制 三溴乙醇（tribromoethanol），10 g；叔戊醇（tertiaryamyl alcohol)，10 ml；PBS，390 ml。混匀后，4 ℃ 避光保存。
（2）0.05％ 胰蛋白酶的配制 PBS，100 ml；胰蛋白酶，0.05 g；EDTA-Na2，0.004。待胰蛋白酶和 EDTA 充分溶解后，用 0.22 μm 滤器过滤除菌，-20 ℃ 保存，保持无菌。
（3）0.1％ 明胶溶液的配制 PBS，100 ml；明胶粉剂，0.1 g。高压灭菌。4 ℃ 保存，1 个月内使用。注意：明胶不易溶于 PBS，高温灭菌后能充分溶解，呈透明液体。
（4）MEF 培养基的配制 MEF-I 培养基（MEF 原代分离时使用）DMEM 培养基，900 ml；胎牛血清（56 ℃ 热灭活 30 min），100 ml；非必需氨基酸，10 ml；100x 青霉素-链霉素溶液，10 ml。
将所有组分混合后，用 0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃ 保存，保持无菌。
（5）MEF-C 培养基（MEF 培养时使用）DMEM 培养基，450 ml；胎牛血清（56 ℃ 热灭活 30 min），50 ml；200 mmol/L L-谷胺（使用前冷冻保存），5 ml；非必需氨基酸，5 ml。将所有组分混合后，用 0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃ 保存，保持无菌。
（6）冻存液的配制 DMEM 培养基，60 ml；DMSO，20 ml；胎牛血清（56 ℃ 热灭活 30 min），20 ml。将所有组分混合后，用 0.22 μm 滤器过滤除菌。每次使用前新鲜配制。
（二）MEF 的复苏
（1）将冻存的 MEF 从液氮中取出，浸入 37 ℃ 水浴，轻轻转动，注意冻存管盖不要没入水中。
（2）当只剩一个小冰晶时，将冻存管从水浴中取出。
（3）将冻存管浸入 95％ 乙醇浴消毒，在无菌超净台中晾干。
（4）将细胞从冻存管中转入 15 ml 离心管中，逐滴加入 4 ml MEF-C 培养基，轻轻混匀（5）200 g 离心 5 min，去除冻存液。
（6）去除上清液，将细胞团轻轻拍散，加 10 ml MEF-C 重悬细胞。
（7）将细胞悬液转移到无明胶包被的 T75 培养瓶中。
（8）放入培养箱，每天观察细胞密度。
（三）MEF 细胞的传代（按 1:5 传代）
（1）吸弃 T75 培养瓶内的 MEF-C。
（2）加 5 ml PBS，洗一遍。吸弃 PBS。
（3）加入 2 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液，放置 3～5 min，镜下观察，看细胞间接触由致密逐渐变松散。
（4）轻拍培养瓶 3～5 次，直至细胞层从培养瓶表面脱离。
（5）加 5 ml MEF-C 中止胰蛋白酶消化。
（6）混匀细胞悬液，加入 40 ml MEF-C，至总体积 50 ml。混匀。
（7）将 50 ml 细胞悬液，按每个新 T75 培养瓶 10 ml 细胞悬液分瓶。
（四）MEF 饲养层的制备
（1）按细胞传代步骤消化 MEF 细胞。
（2）取 0.6～1 ml 混匀的细胞悬液，放入 1.5 ml EP 管。
注意：一定要彻底混匀，以避免细胞不均匀造成很大的细胞计数误差。
（3）剧烈吹打细胞悬液，使细胞团彻底打散。
（4）每次取 10 μl 进行细胞计数，计三次，取均值。
（5）计数出细胞悬液的细胞浓度，按需要的细胞数，取相应体积的细胞悬液体积。
（6）将计数好的细胞悬液转入 15 ml 离心管。
注意：每个离心管的细胞悬液体积不要超过 10 ml，不要离心使细胞沉淀。
（7）照射细胞，摸索合适的照射剂量。
注意：要达到 MEF 细胞的失活所需要的照射剂量变化很大，需要摸索。5500～8000 rads 是经验开始剂量（8）照射结束后，200 g 离心 5 min。
（9）去除上清液，轻轻拍散沉淀的细胞团，按照射前计算好的细胞数，用 MEF-C 重悬细胞，调整细胞浓度为 1x106 个/ml。
（10）进一步稀释细胞悬液，到需要的细胞浓度。注意：用于饲养层时，细胞的浓度为 0.75 x 106 个/ml，6 孔板每个孔加 2.5 ml 细胞悬液。
（11）预先用明胶包被 6 孔板。在 6 孔板的每个孔加入 1 ml 0.1％ 明胶溶液，在 37 ℃ 培养箱中放置 0.5 h 以上。
（12）将培养板从培养箱取出，吸去多余的明胶。
（13）6 孔板每个孔加入 2.5 ml 细胞悬液。
（14）培养过夜，使细胞重新贴壁。
（五）实验结果及分析
每一批饲养层制备好后，需要进行胚胎干细胞培养，鉴定其支持干细胞生长的能力。
注意事项
（1）操作过程中始终注意无菌概念：取胚胎的时候，酒精灯一定放在旁边。
（2）剪胚胎时，要充分点，不能有大的组织块。
（3）去内脏和血块要彻底，血液会影响胰蛋白酶消化。
（4）消化时间要控制好，不宜太长，时间越长团块越黏，细胞不容易被离出。
（5）吹打黏性物质一定要轻轻的，不能太猛烈，否则影响细胞活力，团块更吹不散。
（6）黏性物如果真吹不散，可以先过滤上层液，再用 30 ml 或 50 ml 的针筒，轻轻地吹 2～3 次，切勿用力吹，以免细胞死亡，再换滤网过滤，同时用培养液冲洗。
（7）一般 MEF 培养 1～2 代冻存备用。
（8）照射处理后的 MEF 尽快使用，一般不使用超过 5 d 的饲养层细胞。
来源：丁香实验
