干细胞稳定转染

外源基因进入细胞主要有三种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法，实际上其基本原理都是利用不同的方法在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入，但是由于前两者的效率低且伤害较大，所以现在除了对于一些特殊细胞系，一般的转染方法都利用脂质体。

利用脂质体转染和其他方法一样，最重要的就是防治其毒性，因此脂质体与治理的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

本实验学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法 — 脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白）。

【试剂与仪器】

1 、胎牛血清。

2 、双抗溶液（链霉素 100μg+ 青霉素 100 单位）。

3 、DMEM 培养基。

4 、转染试剂（ LIPOFECTAMINE 2000 ）。

5 、细胞培养基（ DMEM+10%NCS ）。

6 、PBS 。

7、无血清培养基。

8 ．胰酶（ Trypsin ）。

9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机， 15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和 CCD 。

【操作步骤】

（1）转染条件的优化

为了得到最高的转染效率和最低的非特异性的效果，优化条件是必要的，其中包括细胞的密度以及DNA和脂质体的含量。要确保细胞的汇合率大于90％，调整DNA和脂质体的比值从1:0.5 到1:5来进行优化。

（2）正式转染步骤

1 、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为 90% 。细胞铺板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2、对于每孔细胞，使用 50μl 无血清 DMEM 培养基稀释 0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。

3、对于每孔细胞，使用 50μl DMEM 培养基稀释 1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。 LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合。保温时间过长会降低活性。

4、混合稀释的 DNA （由第 2 步）和稀释的 LIPOFECTAMINE 2000 （由第 3 步）。在室温保温 20 分钟。复合物可以在室温保持 6 小时稳定。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。

5、直接将复合物加入到每孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为 0.5ml 无血清培养基。

6、在 37℃ ， 5 ％的 CO 2 中孵育 24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。

7、在细胞中加入复合物 24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。

对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。