HSV－2病毒培养问答

问：现在我在做HSV－2的培养。接种的细胞是Hep－2细胞，对HSV-2是敏感的。曾经复制过一次，3天后出现典型的CPE，效果很好。但是这次不知道怎么回事，4天了还是没有出现CPE，而且培养基都快变黄了。pH值对病毒的吸附、复制影响大吗？我该怎么办呢？盲传是怎么回事？

答：是不是两批接毒量不一样呀？如果毒量小的话，可能出现的晚，但也会出现的，同时与细胞的培养情况与有关的。盲传就是在不知是否有病毒的情况下，或者是在毒量很少，而你不能确定时，仍旧收毒，然后继续接毒，连续几批，如果有毒就会出现CPE，如果没有就不会出现的。

问：谢谢！接种病毒是一样的，另外，我用的是100ml的培养瓶，为了得到高滴度的病毒悬液，我只加了2ml的维持液。到今天培养液快变黄了。还有pH值影响病毒的复制吗？我收获病毒是为了造模。所以滴度越高越好。

答：1、维持液加的太少了，所以变黄了，一般我们10ML的培养瓶是加1ML的维持液，维持液的PH值有很大关系，但是这个必须自己根据自己的细胞和病毒来摸条件；还有要注意在培养箱里的条件，我们做SV40病毒，就发现在96孔板中病变效果很好，可是在培养瓶中就不好，初步考虑和C02的接触面积有关系。

另外变黄也是正常的，当你把培养瓶拿到室温中，如果变红那肯定是没有问题的。你要得到高滴度的病毒，首先就要给其足够的营养，否则它不会长的，或者生长速度肯定要慢的。关于PH值，我相信肯定会影响病毒地复制的，但是在一个范围内病毒仍然可以复制的。

HSV为疱疹病毒科，可能是以出芽方式完成装配过程，至于在细胞中能否找到，我考虑不得可能找到完整病毒颗粒，或许能找到没有装配好的核衣壳。我不敢肯定，因为我没有做过的，但是我想你可以试一试的，用病毒液及细胞两种分别电镜观察，就可以知道了。

另提醒一下，第二次传的毒会不会有冻溶失活的可能？或者只是部分失活，导致接种病毒滴度不够。你曾经复制成功的“曾经”离这次接种有多久了？病毒保存在70度冰箱也最好要2年活化一次再保种的。如果你接种后PH变化不是特别明显（一天或半天的就变成黄色），应该问题不大的。细胞生长代谢本身也产酸的，何况你只用了2ml的维持液。如果PH变化特别明显，可能是CO2浓度不准了。你可以校正一次试试。培养基可以用HEPERS调PH，这样缓冲能力比较强点，不容易变酸。

2、直接拿细胞沉淀看电镜，我觉得难度可能有点。它没有像组织切片一样效果，也没有用超速离心浓缩纯化病毒颗粒达到的浓度和纯度的要求。看电镜前，先搞清楚病毒的增殖特性，再考虑用什么方法进行吧。看电镜时，最好找个电镜高手帮着看看，如果病毒浓度不够的话，很可能会半天也找不到病毒颗粒的。

3、hsv-2在vero（绿猴肾细胞）或用bhk细胞（地鼠肾细胞）中生长好、cpe比hep-2明显，12h左右就可以观测到明显的cpe。我们实验室用vero培养hsv一般12h就可以观察到明显的cpe，而hep-2的cpe没vero的cpe形态好观察。建议你换用vero。