Q-1: 《限制酶在各种通用缓冲液中的相对活性》中记载了限制酶在各种通用缓冲液中的相对活性，但有时其它的缓冲液比产品附带的缓冲液具有更高活性 (例如Hind III附带的缓冲液是M，但缓冲液K显示出200%的活性)。在这种情况下，选用相对活性高的缓冲液进行反应，有没有问题?
Q-2: 为什么有些限制酶的附带Buffer，使用的是比Basal Buffer相对活性要低的Universal Buffer?
Q-3: 底物DNA没有被所用限制酶切断，为什么?
Q-4: TaKaRa限制酶可以稀释使用吗?
Q-5: 怎样确认酶切位点是否被甲基化?
Q-6: 酶切位点被dam或dcm甲基化，要想切开怎么办?
Q-7: 限制酶活性定义的1 U是在37℃条件下，经1小时，将1 µg λDNA完全切断的酶量，对所有的底物DNA都可以完全切开吗?
A-8: 设计引物做PCR扩增时，酶切位点的保护碱基如何设计比较合适?
Q-9: 在限制酶的有关甲基化的影响项目中提到的CG methylase、dam methylase、dcm methylase的影响是怎么一回事?
Q-10: 限制酶名称一栏中写有Sau3A I (Mbo I)，这两种限制酶可以一样使用吗?
Q-11: 是否有同步双酶切的反应条件?
Q-12: 底物DNA经酶切后，电泳无条带或出现Smear现象，如何解决?
Q-13: 乙醇沉淀的方法?
Q-14: 简并碱基的种类有哪些?
Q-15: 酶切产物是否可以用苯酚/氯仿抽提、切胶回收和片段回收试剂盒纯化?
Q-16: 引起Star活性的因素及抑制的方法。
Q-1: 《限制酶在各种通用缓冲液中的相对活性》中记载了限制酶在各种通用缓冲液中的相对活性，但有时其它的缓冲液比产品附带的缓冲液具有更高活性 (例如Hind III附带的缓冲液是M，但缓冲液K显示出200%的活性)。在这种情况下，选用相对活性高的缓冲液进行反应，有没有问题？
A-1: 没有问题。附带的缓冲液是进行活性测定的缓冲液，选择了与原来的基本缓冲液组份相近的缓冲液，未必是活性最高的缓冲液。使用附带的缓冲液以外的缓冲液进行反应，也是没有问题的，但数字上加 ( )的缓冲液，是易受Star活性等影响的缓冲液，应避免使用。 ↑TOP
Q-2: 为什么有些限制酶的附带Buffer，使用的是比Basal Buffer相对活性要低的Universal Buffer?
A-2: 为了方便实验操作，TaKaRa采用了通用缓冲液 (Universal Buffer)的限制酶活性表示方法，同时也能满足双酶切反应 (Double Digestion)的要求。本公司的限制酶尽可能地配备Universal Buffer。例如：L、M、H Buffer等。对一些常用的限制酶，还对同步双酶切反应条件作了严格的研讨，其结果见《Double Digestion (双酶切反应)时Universal Buffer (通用缓冲液)的使用表》，请参考使用。而对一些在5种Universal Buffer中相对活性都不太高的限制酶，附带其Basal Buffer。但请注意，因为Basal Buffer为各种限制酶的最适Buffer，其组成也根据酶种类的不同而不一样。 ↑TOP
Q-3: 底物DNA没有被所用限制酶切断，为什么?
A-3: 可以考虑以下几种情况：
1. 底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA，碱基易发生缺失、变化等。
2. 限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响，请参考《甲基化对限制酶活性影响》的表格，其中做了详细说明。
3. 底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下，底物DNA须重新进行纯化。
4. 限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置，对酶切反应也有一定的影响。
5. PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换Buffer，避免PCR产物中带入的其它物质影响酶切反应。据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。
6. 不同公司的酶和Buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。 ↑TOP
Q-4: TaKaRa限制酶可以稀释使用吗?
A-4: 不稀释为好，TaKaRa的限制酶都根据最佳反应体系配制了浓度。酶制品稀释时，酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA不能切断之现象。 ↑TOP
Q-5: 怎样确认酶切位点是否被甲基化?
A-5: 一般情况下，从大多数的大肠杆菌中提取的DNA，几乎都存在被甲基化的现象，其相对应识别序列的受甲基化影响的限制酶即切不开该酶切位点。而只有在转化时选用了甲基化酶欠损的大肠杆菌作为宿主，提取的DNA才不会被甲基化。在实际操作中，如果使用受甲基化酶影响的限制酶对从一般的大肠杆菌中提取的DNA进行酶切反应，而没切开，或者对测序结果有酶切位点的片段，切不开，其酶切位点被甲基化的可能性就比较大，这时就要选用不受甲基化影响的限制酶进行酶切。 ↑TOP
Q-6: 酶切位点被dam或dcm甲基化，要想切开怎么办?
A-6: 一种方法是，选用不受dam、dcm甲基化影响的限制酶进行酶切反应。例如Sau3A I、Mbo I具有相同的酶切位点，但Mbo I受dam methylase的影响，而Sau3A I不受dam methylase的影响。另外一种方法是，使用dam、dcm甲基化酶欠损的宿主菌 (例如GM33、JM110)进行DNA的转化和制备。还可以使用PCR方法对该DNA进行扩增，然后再进行酶切。 ↑TOP
Q-7: 限制酶活性定义的1 U是在37℃条件下，经1小时，将1 µg λDNA完全切断的酶量，对所有的底物DNA都可以完全切开吗?
A-7: 由于底物DNA的不同，其含有的酶切位点的摩尔浓度不同，空间结构也不相同，这些，都会对酶切反应的速度产生影响，所以，相同的酶量，不一定能将不同的底物切开。 ↑TOP
Q-8: 设计引物做PCR扩增时，酶切位点的保护碱基如何设计比较合适?
A-8: 各种限制酶，所需要的酶切位点的保护碱基的数量不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基，即可以满足几乎所有限制酶的酶切要求。 ↑TOP
Q-9: 在限制酶的有关甲基化的影响项目中提到的CG methylase、dam methylase、dcm methylase的影响是怎么一回事?
A-9: 通常情况下，来自于哺乳类生物的基因组DNA中的CG序列，被CG methylase甲基化，形成5mCG。另外，由于生物学实验操作中被普遍使用的大肠杆菌 (JM109、HB101等)几乎都含有dam methylase和dcm methylase，从这些宿主中提取的质粒DNA的GATC、CCWGG序列被甲基化，分别形成G6mATC、C5mCWGG。受甲基化影响的限制酶切不断其识别序列中被甲基化的DNA。所以，用于反应的DNA，会因为来源不同而出现切不开的现象。因此，在反应之前，一定要对DNA被甲基化的情况和所使用的限制酶受甲基化影响情况进行确认。 ↑TOP
Q-10: 限制酶名称一栏中写有Sau3A I (Mbo I)，这两种限制酶可以一样使用吗?
A-10: 限制酶名称( )里记载的是该限制酶的同裂酶(Isoschizomer)。具有相同的识别序列的限制酶互称为同裂酶。Sau3A I和Mbo I是具有相同识别序列和切断位置的同裂酶，Mbo I由于受dam methylase的影响，不能够切断来自于一般大肠杆菌的DNA。而Sau3A I不受dam methylase的影响，可以切断一般大肠杆菌由来的DNA。有些同裂酶切断位置不一样，即虽然识别序列一样，但切断位置不同，使用时必须注意。另外，即使是切断位置相同的同裂酶，其受甲基化的影响情况有时也不一样。 ↑TOP
Q-11: 是否有同步双酶切的反应条件?
A-11: 请参看《Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表》，选择双酶切反应时的通用缓冲液。TaKaRa公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，同步双酶切通用缓冲液表格中所推荐的双酶切Buffer完全是依据具体实验结果得到的。
TaKaRa公司为了方便限制酶的统一使用，采用了通用缓冲液（Universal Buffer）系统，并列出了各种限制酶在各种缓冲液中的相对活性，如果需要使用两种限制酶进行双酶切反应时，我们可以挑选一种通用缓冲液进行双酶切反应，其条件是：两种酶在这种通用缓冲液中的相对活性都比较高（60%以上）。
如果两个酶切位点相邻或没有共同Buffer的，通常单酶切，即先做一种酶切，乙醇沉淀纯化后，再做另一种酶切。 ↑TOP
Q-12: 底物DNA经酶切后，电泳无条带或出现Smear现象，如何解决？
A-12: 底物DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase发挥作用，将底物DNA降解。可以使用其他限制酶酶切底物DNA，也可以使用此酶切其他底物DNA，来验证酶和底物DNA是否有问题。如果质粒酶切出现此情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。 ↑TOP
Q-13: 乙醇沉淀的方法？
A-13: 乙醇沉淀的方法如下：
1. 加入1/10体积的3 M CH3COONa(pH 5.2)，混匀。
2. 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30～60分钟。
3. 12,000 rpm，4℃离心10 min，回收沉淀。
4. 用1 ml 70%的预冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃离心10 min，除去上清，真空或室温干燥沉淀，注意不要干燥过度。
5. 沉淀用灭菌蒸馏水或TE溶解，进行后续反应。 ↑TOP
Q-14: 简并碱基的种类有哪些?
A-14: 简并碱基的种类表示如下：
M：A or C R：A or C S：C or G
K：G or T Y：C or T H：A or C or T
N：A or C or G or T W：A or T D：A or G or T ↑TOP
Q-15: 酶切产物是否可以用苯酚/氯仿抽提、切胶回收和片段回收试剂盒纯化？
A-15: 以上的纯化方式都可以对酶切产物进行纯化。但是一般苯酚/氯仿抽提和切胶回收的损失比较大。分步酶切的中间产物可以使用乙醇沉淀和片段回收试剂盒 (在允许纯化的片段长度范围内使用)进行纯化，这样操作可以减少损失。 ↑TOP
Q-16: 引起Star活性的因素及抑制的方法？
A-16:
引起Star活性的原因：
1. 较高的甘油浓度（>5% v/v）。
2. 酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>100 U/µg）。
3. 低盐浓度（<25 mM）。
4. 高pH值（pH>8.0）。
5. 存在有机溶剂（如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等）。
6. 用其他二价离子替代镁离子（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。 Star活性是内切酶的一种普遍现象，但是大多数可以控制，正常情况下使用宝生物提供的缓冲液就不会出现Star活性。
抑制Star活性的方法：
1. 尽量使用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。
2. 尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。
3. 将离子浓度提高到100～150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。
4. 将反应缓冲液的pH值降到7.0。
5. 二价离子使用Mg2+。
(责任编辑：大汉昆仑王)
