石蜡切片免疫组织化学染色

1．烤片

烤片的目的是将带有蜡的组织切片牢固地黏在载玻片上，以免染色过程中切片脱落。切片在56~60℃的恒温箱中至少放置1小时才能达到此目的，但是，通常的烤片温度为；8～60℃，时间为2~6小时。由于高温干燥可加速组织中抗原的氧化，因此高温烤片对抗原有破坏作用。

2．脱蜡和水化

分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15～30分钟，以脱掉组织中的蜡。但是，进人组织中的二甲苯不能与水溶性染色液相溶，故需进一步通过下行梯度乙醇把组织中的二甲苯逐步替代出来。切片在100%乙醇工、Ⅱ中分别浸泡5分钟，95%、90%、80%和70%乙醇中分别浸泡2分钟，PBS漂洗3次，每次3分钟，置蒸馏水中待用。

3．抗原修复

4．细胞膜打孔

切片置于0.1%~0.3%TritonX-100中，室温浸泡25分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。TritonX-100为去污剂，其脂溶性可使细胞膜穿孔，增加细胞膜对抗体的渗透性。检测细胞膜抗原时可免去此步骤。

5．灭活内源性酶及封闭内源性生物素

6．非免疫血清封闭

抗体能被组织切片中富有电荷的胶原和结缔组织成分吸附。从而导致背景着色，为了防止这种现象发生，最好在特异性抗体处理切片之前，选择与二抗种属相同的非免疫血清封闭电荷，阻止一抗与之结合，抑制非特异性背景着色。常用方法是用2%～10%羊血清或2%～5%牛血清白蛋白在室温下作用10~30分钟。但应注意此种结合不牢固，所以最好不要冲洗，倾去余液直接加一抗。SABC或SP免疫组织化学试剂盒中常配有非免疫血清。

7．第一抗体孵育

滴加特异性一抗于切片上，4℃孵育24～48小时，或室温孵育过夜，也可在37~C孵育1～2小时。之后，用PBS冲洗3次，每次5分钟。一抗分为多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体的抗原专一性较差，非特异性反应较明显，效价不太稳定。但多克隆抗体制备简便，价格低廉，抗体效价较高，稀释度一般在1：100～1000之间，高者可达1：数万。

利用单克隆抗体制备技术制备的单克隆抗体特异性强，无交叉反应，质量和效价稳定，非特异性反应较少，标记结果可靠，在应用中有更多的优越性。但单克隆抗体制备复杂，价格昂贵，抗体效价较低，稀释度在1：50～100。抗体的选择是开展免疫组化染色最重要环节之一。

市场销售的一抗大部分来源于国外，生产厂家各异，因此，对购入的抗体首先要进行预实验检测。试剂公司在销售抗体时附有说明书，包括抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子强度和pH值等。

市场销售的一抗分为即用型和浓缩型两种，对前者抗体的效价无需摸索，但对于浓缩型一抗，则应摸索出最佳的工作效价，抗体浓度过高或过低都将可能出现阴性结果，应该以一个适当的稀释度得到最佳的抗原染色强度和最低的背景着色。稀释特异性抗体常用含1%～3%非免疫血清的PBS，需现配现用，稀释后的一抗存放时间不可超过三天。

8．生物素标记第二抗体孵育

滴加稀释度合适(按说明书推荐的稀释度或预实验摸索)的生物素标记二抗于切片上，室温孵育1小时，继而PBS漂洗3次，每次5分钟。二抗有抗鼠、抗兔和抗羊等之分，特异性要与一抗匹配，否则，一抗和二抗连接有误可导致假阴性染色结果。例如，兔抗鼠或人的一抗需与抗兔的二抗匹配，小鼠抗大鼠或人的一抗需与抗小鼠的二抗匹配。目前，生物素化二抗多以即用型形式存在于SABC或SP免疫组织化学试剂盒中，故无需考虑其浓度。

9．SABC-POD或SABC-AP孵育

滴加稀释度合适(按说明书推荐的稀释度或预实验摸索)的ABC-POD或SABC-AP于切片上，室温孵育10~30分钟，随后PBS漂洗4次，每次5分钟。SABC或SP试剂盒中的即用型试剂无需稀释。

10．显色

显色是免疫组化染色的最后关键步骤，一般过氧化物酶的检测系统选用DAB或AEC显色。前者显色为棕色，后者为红色。要得到最佳的显色效果，必须在镜下严格控制，以检出物达到最强显色效果而背景五色为终止点。

根据经验，DAB在配制后最长放置时间是30分钟以内，过时则不能使用，DAB滴加到组织切片时作用时间最长不宜超过10分钟(最好在5分钟内)，否则不管有无阳性结果均应终止反应。对一些富含内源性酶的组织用DAB显色时极易出现背景色，应尽早在镜下控制，以达到最佳分辨效果。

DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时洗手，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24小时后方能再次使用。AEC显色系统的弊端是易溶于有机溶剂，所以封片时应以水性封片剂为主，故染色切片不能长期保存。

免疫酶染色时，酶底物浓度的增加或孵百盯面雨延长，均可增强染色强度。过氧化物酶显色时，H₂ O₂ 浓度较大使显色反应过快而致背景加深，且过量H₂ O₂ 能抑制酶的活性，故H₂ O₂ 浓度要适中。

如果上述步骤使用链霉亲和素―生物素―碱性磷酸酶复合物，则需选用NBT/BCIP作为显色系统．阳性结果为蓝黑色。显色后蒸馏水或自来水冲洗。采用碱性磷酸酶作为标记物底物时，染色过程中的缓冲液用0.02mol/LTBS(pH 8.2)较好。

11．苏木精复染细胞核

为使组织切片清晰的显示组织结构，便于准确定位，常对切片进行复染。最常使用的细胞核染料为苏木精，也可根据情况使用甲基绿和核快红。染色约10秒，镜下控制着色程度，效果好时自来水冲洗返蓝。

12．封片

如果选用DAB显色，则切片经过梯度乙醇脱水(80% 乙醇2分钟，95%乙醇2分钟)，乙醇Ⅰ 和100%Ⅰ乙醇Ⅱ各5分钟，二甲苯Ⅰ 和Ⅱ各透明5分钟，最后中性树脂封固；如果选用AEC显色，则切片不能经乙醇脱水，冲洗后拭干直接用水性封片剂封片。