原代细胞鉴定技术

一、形态学鉴定
1. 在倒置显微镜中直接观察活细胞的形态学特征

2. 细胞染色检查 ：
a) 将无菌玻片置于细胞培养皿中，加细胞悬液后培养；

b) 待细胞长满玻片后取出，用PBS清洗，之后放于载玻片上，待其自然干燥；

c) 用PBS/甲醇（1:1）固定15分钟；

d) 弃固定液，加合适的染色液染色；

e) 染色完毕后用清水洗净，置于空气中干燥，

f) 干燥后，用二甲苯透明，光学树脂封片后观察。

二、免疫组织细胞化学鉴定
1. 将无菌的盖玻片置于细胞培养皿中，将细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片；

2. PBS清洗标本3次，各1 分钟；

3. 4%多聚甲醛固定15分钟；

4. 置于空气中干燥；

5. PBS清洗标本3次，各2 分钟；

6. 0.5%Triton X-100孵育 1次20分钟；

7. PBS清洗标本 3次 各2分钟；

8. 3%H2 O2 孵育 15分钟；

9. DPBS清洗标本 3次 各2 分钟；

10. 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液20分钟）

11. 一抗孵育，4℃ 过夜或37℃ 60 分钟；

12. PBS清洗标本3次 各5 分钟；

13. 二抗工作液孵育（湿盒）37℃ 30 分钟；

14. PBS清洗标本3次 各5 分钟；

15. C液（湿盒） 37℃ 30 分钟；

16. PBS清洗标本3次，各5 分钟；

17. 用显色液进行显色；

18. 蒸馏水洗涤2次1 分钟；

19. 苏木素复染1分钟；

20. 清水洗涤30分钟；

21. 光学树脂封片后观察。