ELISA质量控制

ELISA 是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域。ELISA 的影响因素较多，加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。

一、质量控制血清

质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。

1.质控血清的使用

卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在-20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。

自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。

2.临界值质控血清

质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。 临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。

3.质控血清的制备

每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备本室使用的质控血清（以乙肝质控血清为例）。

（1）收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。

（2）56℃加热10小时来活。

（3）离心或过滤除去沉淀。

（4）用10%的小牛血清或正常人血清（PBS缓冲液）将收集的血清稀释至所需的浓度。如能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。

（5）抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃保存备用。不可反复冻融。被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要求，则应加所要求浓度的质控物。

（6）标定含量。20-30次测定结果删除>±2SD数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对比测定。

二、室内质量控制程序

临床检验的检测结果，每次或每天之间不可能没有误差。决定允许的误差范围，以临床上不造成误诊与漏诊为准，通过以下步骤来确定质控范围。

1.最佳条件下的测定误差

最佳条件下已知值质控血清变异（optimal conditions variance,简称OCV）的测定：在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20-30次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD）表示该实验室的最佳工作质量。

现举例说明HBsAg ELISA法检测时OCV的测定。使用的质控制血清为临界血清，HBsAg浓度为5ng/ml。在该实验室中选择素质最好、操作最熟练的技术员进行认真地专门测定，选用最佳的试剂盒，检测之前，将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试，使用新的加样吸头等，即在最佳、最理想的条件下进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照品和阳性对照品。并作双份测定，得出2个吸光值（A值），求出X。连续作20次，求出20个X，即X1……X20。从这20个数据中，求出OCV的X和SD。

2.已知值的血清在常规检验条件下的误差

常规条件下已知值质控血清变异（routine conditions variance-known value,简称RCVK）的测定：做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更小，说明OCV不是最佳条件下测定的，应重新再测OCV。常规条件下，RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发出。

3.未知值的血清在常规检验条件下的误差

常规条件下,未知值质控血清变异(routine conditions variancl-unknown value 简称RCVU)的测定：有时为了避免主观性,再作RCVU测定。测定步骤同RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。

4.临床应用的要求

对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。

三、室间质量评价（external quality assessment,简称EQA）

室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告，而是一种回顾性评价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制试验结果的准确度，不能互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。

1.室间质评的方法

（1）发质控物进行调查

这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。 这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果不能反映该实验室日常工作水平。

（2）派观察员到实验室进行试剂调查

这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组标本，进行评价。这种调查方式，容易发现该实验室存在的实际问题，可以直接给予指导和帮助，解决问题，提高检验质量。这种调查通常可以使用真实样本，避免采用质控物的一些缺点。

2.评价方法

（1）发质控物进行调查，这是目前国内外常见的形式，采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将结果报至组织者（部、省临检中心）。组织者通过统计分析，再将评价结果寄回实验室，使其了解工作质量，发现问题，提高质量。其缺点为由于各实验室吃小灶或互相打电话修改结果而达不到真正评价作用。

（2）现场调查，事先不通知，临时派出人员到各实验室，规定采用常规方法，检测一组标本，进行评价。这种方法可以解决实际问题，进行现场指导，组织者常因人力、物力的原因而不能经常性进行。

3.成绩计算方法

（1）定性试验：检验结果与预期结果一致，得 100 分，错误不得分，总计实验室的得分。从全部参评单位的得分中求出该批质控物平均分（X）和标准差（s），再通过公式计算出每一个实验室的得分比值（SI）

SI=（实验室得分-平均分）/平均标准差（s）

SI 在0.0-0.9 间为良好,1.0-1.9 间为优秀,SI 为负值时数值越大成绩越差。

（2）定量试验：SI= （实验室测定值-预期值X）/预期值的标准差s ; SI 越小，表明越靠近靶值，成绩越好。

0-1.0 为优秀,1.1-2.0 为良好,>2.0 为差。SI 无正负之分

四、质量改进（Quality Improvement，QI）

质量改进的建议来源于三方面：

（1）室内质控：提示实验的精密度差，应规范各项操作；

（2）室间质评：提示实验的准确性差，应改进设备的准备或更换试剂；

（3）病人或医生的报怨：提示实验的偶然误差，应分析实验的质控过程是否达标。

五、记录

1.所有实验的原始资料均应存档；所有的记录均应规范登记在册；原始登记表应记录试剂来源、批号；质控血清的来源及测定值并注明是否在控；签上实验者姓名及审核者姓名。

2.如试验结果对临床诊断有决定意义，其样本应保留，至少与病历保存期一致。