ELISA的质量控制问题

从1949年美国College of American Pathologists（简称CAP）首先开始研究临床实验室室内质量控制（简称质控）问题，美国学者Levery和Jenning于1950年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉序幕。

到70年代，实验室质量控制进入一个新的阶段--全面质量管理，推行Good Laboratory Parctice（简称GLP）。进入80年代末期，GLP的统一标准产生了，发展到"认证实验室"管理阶段。

全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重要环节。

本章节主要介绍免疫学检验的统计学室内质控方法。因为ELISA是目前临床上最常用的一种免疫学检验方法，就以ELISA检验为例，介绍一下有关问题。

卫生部临床检验中心免疫质控室从1988年开始在全国范围内开展乙肝标志物检验的质量评价活动，一直采用这一套质量评价方法，并在实践中不断实践、提高和完善，希望能找出一条适合中国国情的，行之有效的质量管理的道路。

一、基本概念

（一）质量控制（Quaility Control,Q.C）

质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的。

（1）确定控制的对象；

（2）规定控制对象的标准（预期值）；

（3）制定或选择控制方法和手段；

（3）测量实际数据；

（4）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。

（5）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。

质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的"控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的"可追查"性原因。"可追逆"性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。"控制限"是通过统计计算出来的，在后我们将详细介绍（见5.3.室内质控程序）。

（二）误差

实验误差分为三种：系统误差、随机误差和过失误差。

系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律性，可在一定条件下重复出现，是可以通过质控预防和校正的。

随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是难以避免和校正的误差。检验工作中随机误差的分布符合正态分布规律。

过失误差是人为的责任误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免的。

（三）正态分布及标准差

ELISA试验中，检验同一样本达20次以上时，就会发现这组数据（指测定结果的吸光值）分布在均值两侧，大部分集中在均值附近。如果以测定值为横坐标，以出现的频率为纵坐标作图，就可绘出一个呈钟形的曲线图。如图5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为中心对称分布，这就是正态分布。

正态曲线以下的面积称概率，常用样本的均数（X）和标准差（SD）来表示，其计算方法如下：

均值、标准差和概率的关系如下：

X±1SD，概率0.68 X±2SD，概率0.95 X±3SD，概率0.99

换言之，当ELSIA检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值（X）的±1SD范围内的数据，占该组数据的68%，在X±2SD范围内分布的数据占总体的95%，在X±3SD范围内分布的数据占总体的99%。当我们要求检验结果在X±2SD范围内为合格时，将有95%的数据可能合格。

（四） 真值

用确切的、最理想的决定性方法测得的值，称为真值。真值一般是测不到的。通过可靠的决定性方法测出的值，称为靶值，通常用靶值来表示真值的大小。

（五）准确度（accuracy）

是指测定结果与真值（或靶值）接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确度来衡量。测定结果与靶值的偏离程度称为偏差，它表示该项检验的不准确度。

绝对偏差=检验的均值-真值（或靶值）

相对偏差=绝对偏差真值÷（或靶值）×100%

（六） 精密度（Precision）

是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间的符合程度。

（七）标准品

1、国际标准品 由WHO或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。

2、国际生物学活性标准品根据生物学反应由WHO或相应组织标定的国际活性单位的材料。

3、参考标准血清 国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。

（八） 临床决定性水平（clinical decision leuel）

当某个被测物的浓度达到某一水平时，临床医师必须采用医疗措施。被测物的这浓度称为临床决定性水平。

二、质量控制血清

质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。

（一） 质控血清的使用

卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在-20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。

（二）临界值质控血清

质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。 临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。

（三）质控血清的制备

每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备本室使用的质控血清（以乙肝质控血清为例）。

（1） 收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。

（2） 56℃加热10小时来活。

（3） 离心或过滤除去沉淀。

（4） 用10%的小牛血清或正常人血清（PBS缓冲液）将收集的血清稀释至所需的浓度。如能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。

（5） 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃保存备用。不可反复冻融。被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要求，则应加所要求浓度的质控物。

（6） 标定含量。20-30次测定结果删除>±2SD数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对比测定。

三、室内质量控制程序

临床检验的检测结果，每次或每天之间不可能没有误差。决定允许的误差范围，以临床上不造成误诊与漏诊为准，通过以下步骤来确定质控范围。

（1） 最佳条件下的测定误差。

（2） 已知值的血清在常规检验条件下的误差。

（3） 未知值的血清在常规检验条件下的误差。

（4） 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。

（一） 最佳条件下已知值质控血清变异（optimal conditions variance,简称OCV）的测定在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20-30次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD）表示该实验室的最佳工作质量。

现举例说明HBsAg ELISA法检测时OCV的测定。使用的质控制血清为临界血清，HBsAg浓度为5ng/ml.在该实验室中选择素质最好、操作最熟练的技术员进行认真地专门测定，选用最佳的试剂盒，检测之前，将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试，使用新的加样吸头等，即在最佳、最理想的条件下进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照品和阳性对照品。并作双份测定，得出2个吸光值（A值），求出X.连续作20次，求出20个X，即X1……X20.从这20个数据中，求出OCV的X和SD.

（二）常规条件下已知值质控血清变异（routine conditions variance-known value,简称RCVK）的测定。

做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更小，说明OCV不是最佳条件下测定的，应重新再测OCV.常规条件下，RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发出。

（三）常规条件下，未知值质控血清变异(routine conditions variancl-unknown value 简称RCVU)的测定

有时为了避免主观性，再作RCVU测定。测定步骤同RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。

（四）质控图

通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据RCVK的和SD作质控框图。利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质控图可以连续作下去。 质控血清的S/CO值低于-2SD的范围，属"告警"，应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。

ELISA试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过2SD应作为"告警"，二次超出2SD为"失控"。当质控过程中，出现失控时，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原 因时，应重复进行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。

一般认为：①一次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3-5次连续处于一侧的2SD之内；

④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。

第③、④种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。

（五）统计学计算方法--"即刻性"质控

以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但ELISA有其特殊性，最合适的质控方法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELSIA试剂盒效期短，用一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。"即刻法"的建立具体计算方法如下：

1)先将测定值从小到大排列

2)计算X和SD.

3)计算SDI上限和SDI下限值。

4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值＜n2SD时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI上限和SDI下限有 一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD~3SD范围，处于"告警"状态；当SDI上限和SDI下限有一值＞n2SD时，说明该值已在3SD范围之外，属"失控"。数值处

于"告警"和"失控"状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控的这次数值，其他次测定值仍可继续使用。

即刻性质控统计方法，适于ELISA测定的质控。

当检测的数值超过20次以后，不必再使用"即刻法"质控统计计算，可以转入常规的质控图的质控。将前20次的数值求出的和SD作质控框架图，第21次的数值，依次点入即可。

四、室间质量评价（external quality assessment,简称EQA）

室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告，而是一种回顾性评价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制试验结果的准确度，不能互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。 5.4.1室间质评的方法

（一）发质控物进行调查

这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。

这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果不能反映该实验室日常工作水平。

（二）派观察员到实验室进行试剂调查

这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组标本，进行评价。

这种调查方式，容易发现该实验室存在的实际问题，可以直接给予指导和帮助，解决问题，提高检验质量。这种调查通常可以使用真实样本，避免采用质控物的一些缺点。