大鼠皮层神经元原代培养

液体配制：

硼酸硼砂缓冲液：0.05M四硼化钠45ml，0.2M硼酸55ml，pH8.4；

胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡盐液定容至100ml

所用的培养板、培养瓶或玻片预先经100μg/L多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干备用。

操作步骤如下：

1、孕16d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。

2、在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3、随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液（DMEM＋10％FBS）的离心管内终止消化液作用5min。

4、用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10％FBS的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5、将所收集的上清经200目筛网过滤。

6、过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养液（DMEM＋20％FBS）并吹打成单细胞悬液。

7、细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2种入6孔板内，放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara-C使其终浓度为1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。

【注意以下几点】

1、上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动：如消化时可以直接用0.125－0.25的胰酶消化15－20min左右，也可用DNA酶进行消化，有人还直接进行吹打，都可行。

2、上面虽然时大鼠皮层神经元，但是同样适用于小鼠，但是应该选择 孕13d 左右的小鼠。

3、神经元是一种比较难培养的细胞，因此在接种时细胞的密度一定要够！！

4、在玻片上培养神经元时，一定要注意玻片的来源和处理方法，这个非常重要，对神经细胞的影响是很大的。如果您现在在玻片上培养的神经元生长情况还不错的话，那么您在以后的培养中最好还是用同一来源（厂家）的玻片。

5、如果有B27和neurobasal培养基，那么就方便了（不用加AraC）－－

（1）把细胞悬液用（DMEM＋20％FBS）悬浮，种到培养皿上6－12h后，全量换成2％B27的neurobasal培养基，继续培养，3d半量换液。

（2）把细胞悬液用直接用2％B27的neurobasal培养基悬浮接种。

（3）可以用新生1d内的胎鼠皮层直接培养。