原代培养海马神经元经验

一、常规的试剂配制：

1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；

2、多聚赖氨酸溶液的配制： 称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；

3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制： 称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；

4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；

5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。

二、试验操作过程：

1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被10 min，吸除，无菌操作台上15min自然晾干，置于培养箱中备用；

2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）

3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；

4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化20 min左右，期间轻摇数次；

过滤：加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；

5、接种：以1100 rpm离心5 min，倾去上清，用DMEM/F12培养液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；12小时内禁止晃动

6、换液：接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每3 d半量换液。

此外，原代培养的海马组织由多种细胞构成，如成纤维细胞、胶质细胞等，成分复杂，因此原代培养过程中细胞纯化是关键的一步。本人主要采取以下措施来达到细胞纯化：

（1）海马组织取材时组织定位准确，由于海马游离于大脑皮层，这一点容易做到；

（2）消化前，细心剔除微血管；

（3）过滤时选择150-200目筛网，尽量使培养的细胞呈单个或数个成团；

（4）接种24 h时需全量换培养基，除去未贴壁的死细胞；

（5）接种48 h时加一定浓度的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞（胶质细胞和少许成纤维细胞）的过度生长。