【分享】多重PCR的一些体会
丁香园论坛
这些年一直做一些多重PCR，对多重PCR，有一些自己的小体会，现写出来与大家一道共享并期待与大家的交流。实际求是的说，高通量核酸扩增技术一直是大规模核酸样品检测分析的瓶颈。
现在的样品检测比如基于生物芯片平台的核酸样品检测，都是基于同时对成百上千个样品、上百上千个靶基因位点进行，很不幸的是，现有的核酸扩增技术，当然主要是PCR技术，现有的多重PCR是远远不能满足需求的。因此，现在又很多人都在致力于新型高通量核酸扩增技术的开发，这类方法往往采用了固相分离技术，当然还有一些。好了，今天主要谈多重PCR技术。
（1）我的多重PCR入门在开始多重PCR设计之前，我的单重PCR已经算是做得非常好了，对PCR原理，PCR的数学模型，PCR的引物设计以及各种问题分析已经非常熟悉。后来由于实验需要，开始涉及多重PCR.
在实验开始之前，这边文献《多重PCR的经典之作：Multiplex PCR- Critical Parameter》（文献可以从本论坛下载：我认真研读多遍，并做了详细笔记。应该说，这篇文献对于初涉及多重PCR来说，是个非常好的指导之作，建议认真认真再认真的阅读。
有了把握之后，就开始了多重PCR的引物设计。第一次设计的是个四重PCR，四队引物的设计花了我不少时间，为了保证四队引物的相互兼容性以及扩增效率的一致性，需要对四队引物以及引物对之间逐一配对分析，这里没有巧办法，所需只是耐心和时间而已。
引物设计合成后，开始了配液，当时采用的PCR试剂都是各个单体，不像现在，大家都习惯用商业化的mix，包括 10x Buffer里都是不含MgCl2或MgSO4的，各个试剂之间安装均匀设计表，进行梯度设计。通过PCR后电泳，找出最佳的试剂梯度组合。第一次的实验还算比较顺利，可能是由于前期工作准备得比较好。呵呵，当时看到电泳的四个清晰条件逐次排列，心情是非常激动的。
（2）后期的多重PCR翁曰：无他，但手熟尔。此言真是天大的一句大实话。多重PCR设计多了后，对立面的道道有了一些自己的理解。也开始把PCR简化了。到现在，哪怕是八重九重，我也是按照自己的套路来进行：精心设计引物，试剂配比吗，基本不大动了，顶多增加酶量。呵呵，运气还比较好，成功率算是非常高的。
（3）我的多重PCR实验套路
1、引物设计。一般采用primer 5或primer 6进行引物设计。
多重引物的设计有几个原则：
（a）各个引物对的Tm等参数尽量接近
（b）各个引物对应本本身就是一对优秀的单独的引物对，不要存在严重的二级结构比如发夹，dimers以及误引发。
（c）多重体系中的各个引物，应均按两两组合配对检查两个引物之间会不会存在严重的dimers，记住，是每条引物都要与其他引物配对检查。
2、试剂配比。一般情况下，Buffer、离子浓度、dNTPs是可以按照单管PCR的加入量进行的，他们的量，是足够的。大家可以自己去计算下。酶量，我的建议是要按照单管加入量的1.5倍加入。
3、各个引物对的加入
（a）老老实实先完成各个引物对的单管扩增，保证单管扩增OK!，这步解决不了，先启动下一步。
（b）在多重PCR配液中各个引物对可以按照单管扩增的量（建议采用终浓度0.4uM）等量加入，然后进行PCR，电泳或其他方法观察各个引物对所扩增的产物的强度。扩增弱的，下一步增加该对引物的加入量，扩增太强的，下一步可适当降低该对引物的加入量。
4、PCR扩增条件 没有太大讲究，72度延伸时间足够即可！暂就写到这里，期待与大家的交流！
此贴被转100次，我将免费为大家设计10组多重引物（五重以下）
祝好！
biom
