【分享】细胞总RNA抽提的体会-申请加分

自己整理的protocol,希望对大家有所帮助！

Preparations:
1.  高压2遍的物品及试剂：Ep管[大、中、小]
移液枪头[大、中、小]
0.1%DEPC[sigma]水—v/v, 室温静置过夜-高压2遍（大Ep管分装 后冻与-20℃）
2. 试剂：Trizol[invitrogen]（4度）
100%无水乙醇（生产日期近，越久的挥发越多；及时盖盖）
氯仿（三氯甲烷CH3Cl3）
异丙醇
3. 其它：手套【需要勤换-防止RNA酶降解RNA】；口罩；冰盒；刮匙。半小时前启动4度离心机。基本是室温操作。
Protocol：
1.  收细胞：冰上操作。冷PBS洗皿2-3次，倾斜空净余液，加入Trizol（大皿加1ml，小皿加300ul），然后冻于-80度。
2.  4度解冻samples。（不超声；解冻本身就是裂解过程）。
3.  分相（3-4）。 加氯仿---每个Ep管内加入的体积为该管内Trizol量的1/5。剧烈振荡15s-30s，室温静置15-30min，中间加一次振荡。
4.  离心：12000g，15min，4度（一定要慢减速，下同）。分三层：上—水相含RNA；中—白色含pro.和DNA；下—同中，以及红色苯酚、氯仿。
5.  沉淀（5-6）。小心吸取上层水相至另一新Ep管，加入等体积（原Trizol量的1/2）的异丙醇，颠倒混匀，室温静置5-10min。
6.  离心：12000g，10min，4度。管底可见白色沉淀。
7.  洗涤（7-9）。倒弃上清（注意沉淀不要被带出），加入75%-80%乙醇（v/v用DEPC水现用现配；先加DEPC水，再加无水乙醇-乙醇易挥发）吹打洗涤（每1mlTrizol加1ml的75%乙醇）。
8.  离心：7500g，5min，4度。
9.  倒弃上清，重复7、8。
10.  干燥：通风厨内，室温下5-10min。不能彻底干燥。
11.  稀释：逐步小量DEPC水稀释沉淀，至完全溶解，一定要均一。置于冰上，不用则冻于-80度。
此种方法是改进了RNA提取过程的细节过程，最终提取到的RNA的OD260/OD280一般都能保存在1.8左右。