胶体金标记蛋白质的纯化

标记好的免疫金探针必须经过纯化处理才能用于IHC染色，尤其是免疫电镜的染色。纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。

（一）超迷离心法

根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同，离心的转速和时间也不同。

用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG,可先从低速离心（20nm颗粒用250g;5nm用4800g20min），弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀，然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心1h,20nm和40nm金标记物用14000g于4℃离心1h.小心地吸出上清，将管底沉淀再用1%牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量，平衡过夜后，重复离心2次。

最后一次洗涤离心的沉淀，再用1%牛血清白蛋白缓冲液（含0.02mol/LNaN3）稀释到l:20.40nm金颗粒在520nm检验吸光度为0.35;20nm金颗粒为0.30;5nm金颗粒为0.25,用1%牛血清白蛋白缓冲液作空白。制备的胶体金-蛋白探针可保存于4℃，如加入50%甘油可贮于0℃以下（-18℃）1年以上。

以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金，按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同，用不同离心转速分离纯化，以白磷还原法制备的5.0nm胶体金A蛋白，用125000×g离心；抗坏血酸法制备的11.3nm胶体金-A蛋白，用150000g离心45min,可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀，其上为较疏松的红色沉积物。

再上为透明的上清液。附贴管底的沉淀无用，以后操作步骤中不要搅起来，仍保持其贴于管底。弃去上清液后，用等体积的0.0lmol/LPBS（pH7.2）溶解疏松红色沉积物，同上重复离心1次，小心移去上清液，剩余0.5ml上清液，将疏松红色沉积物溶解后，即为初步提纯的金标-A蛋白试剂。

（二）凝胶过滤法

凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。将前述胶体金-蛋白质复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液，以15000r/min离心15min（或用上述离心法纯化后的胶体金，再进一步用此方法纯化）。

吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400（SephacrylS-400,Pharmacia公司产品，Sweden）色谱柱上分离纯化。柱床高20cm,直径0.8cm,加样体积为柱床体积的1/10.用0.02mol/LTBS液（内含0.1%BSA,0.05mol/LNaN3,pH8.2者用于胶体金标记IgG,pH7.0者用于胶体金标记蛋白A）洗脱，流速为8ml/h,按红色深浅分管收集洗脱液。

可见先滤出的液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质。纯化的金标记蛋白滤出液随浓度增加而红色逐渐加深，清亮透明，此后为略呈黄色的未标记蛋白组分。表中列出胶体金与蛋白质结合后，用离心法纯化的条件。表6-8列出几种免疫金探针离心纯化的条件，仅供参考。

超迷离心转速与金颗粒直径的关系

几种免疫金探针离心纯化条件