免疫胶体金试纸法

一、试剂与仪器

氯金酸；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗；雌二醇标准品、雌二醇单抗、17β-Estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)。硝酸纤维膜、玻璃纤维膜；Beckman Du530分光光度计；低温高速离心机；点膜机。

二、 方法
 

1.  胶体金的制备

用三蒸水溶解氯金酸，使其终浓度为01g/L,先进行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100 ml加入1%柠檬酸三钠25ml，再沸水浴下快速搅拌，直到氯金酸溶液的颜色稳定，继续沸水浴10 min，冷却至室温后，用透射电镜镜检并用分光光度计检测颗粒均匀度及粒度。最后置于4℃冰箱保存备用。

2.  最适标记蛋白量的确定

用0.2mol/L K₂CO₃将胶体金溶液调至pH为8.2，然后取试管9支，分别加入10 ml胶体金溶液。将雌二醇抗体逐级稀释后，各取等体积稀释液顺序加入上述试管中，混匀，另设一不加抗体的对照管。放置10 min，在各管中加入0.1 ml的10% NaCl，混匀后静置2 h。观察各管中胶体金溶液变化，未加蛋白及加入量不足的溶液颜色由红变蓝，而加入蛋白量达到或超过时的溶液则保持不变。标记蛋白量即为最低稳定胶体金溶液不变色的蛋白量基础上再加20%。

3.  胶体金探针的标记

将抗体用0005mol NaCl溶液透析过夜，离心除去蛋白沉淀，调至05mg/ml。取胶体金100 ml，用0.2 mol/L K₂CO₃将胶体金溶液调至pH为9.0，磁力快速搅拌下缓慢加入24 ml稀释的雌二醇抗体，继续搅拌10 min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其最终浓度为1%，再搅拌10 min。将初步制得的胶体金探针以4 000 r/mm离心20 min；弃沉淀，上清以10 000 r/min离心60 min；弃上清，沉淀用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)(含1%牛血清白蛋白)重新悬浮；同前离心洗涤2次，将沉淀用0.1 mol/L的PBS(pH82，含1%BSA，002%NaN₃)悬浮，4℃保存备用。

4.  抗原的合成

小分子物质难以固定在硝酸纤维膜上，只有使它连上大分子物质才能较好地固定。本实验采用混合酸酐法制备完全抗原。雌二醇-6-肟 43 mg，加入三正丁胺5 ul，二氧六环4 ml，冰浴冷却到10℃以下，加入氯甲酸乙酯15 ul。4～10℃下反应30 min。配制卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA 10 mg，3ml水，3 ml二氧六环，1mol/L氢氧化钠03ml)。将配制好的OVA溶液加入反应液，4℃冰浴搅拌6h，反应过程中，用氢氧化钠维持pH值为8.反应完毕后，将反应液加入透析袋，透析2 d。将透析液调至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黄色沉淀出现。离心收集沉淀，冷冻干燥，4℃冰箱保存。将OVA溶于透析液内作为参比，用紫外光谱法对雌二醇-6肟-OVA进行定性检验。经紫外测定证明蛋白质已与雌二醇衍生物结合。

5.  胶体金免疫层析试纸条制备

测试条由玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、加样纸、吸水纸4部分组成。将玻璃纤维膜裁成6mm的细条，然后放入含1% BSA、1%Tween-20的PB液中浸泡30 min，37℃烘干，最后将胶体金探针灌注已处理好的玻璃纤维膜上，真空干燥备用。在硝酸纤维膜上用点膜机将上述抗原和兔抗鼠IgG喷成2条线，分别为检测线和对照线，经真空干燥后，用1% BSA、0.1mol/L PBS（pH9.0)封闭2 h，以0.1 mol/L PBS洗涤，再真空干燥。将30 mm吸水纸、25 mm硝酸纤维膜、6 mm玻璃纤维膜、15 mm加样纸，由顶部依次粘于PVC板上，裁成细条备用。

6.  检测与判读样品

含已知浓度雌二醇样品的乙醇溶液分为3组，第1组不加雌二醇，第2组为0.2 ug/ml雌二醇，第3组为0.4 ug/ml雌二醇。将加样纸一端插入待测液，湿润后取出，水平放置，约3～5 min，观察结果。如试纸条硝酸纤维膜上仅对照线呈一条紫红色带为阳性；如出现2条紫红色带为阴性；如质控线不出现紫红色带，无论检测线是否出现，测试结果均无效。