淀粉酶的活力测定及专一性实验

一. 目的

了解淀粉酶对不同底物的专一性

掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法

二. 原理

酶与一般催化剂最主要的区别之一是它具有高度的专一性。所谓专一性指的是一种酶只能对一种化合物或一类化合物（通常在这些化合物的结构中具有相同的化学键）起一定的催化作用，而不能对别的物质发生催化反应。

例如，淀粉酶只作用于淀粉中的a-1,4葡萄糖苷键，而不能作用于蔗糖分子中a-D-吡喃葡萄糖的C1和b-D-呋喃果糖的C2之间的糖苷键。

蔗糖无还原性，淀粉的还原性也极小，它们对3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）呈阴性反应，而唾液淀粉酶（主要含a-淀粉酶）水解淀粉后的产物则为还原性糖，与DNS试剂共热呈阳性反应，产生红棕色。据此可以检验蔗糖和淀粉有无被唾液淀粉酶水解，从而了解酶作用的专一性。

酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。

本实验是以一定量的唾液淀粉酶液，于37°C、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。这里规定，一个淀粉酶活力单位定义为在37°C、pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需的酶量。

三. 实验材料及设备

1. 材料

唾液

2. 仪器

分光光度计 恒温水浴 沸水浴

3. 器材

刻度试管： 25mL×10

容 量 瓶： 100mL×1

移 液 管： 1mL×4 2mL×2

烧 杯： 250mL×1

滴 管： 2

洗 耳 球： 2

洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1

四. 试剂的配制

1. 淀粉溶液（0.5%）

称取5g可溶性淀粉，溶于1000mL热水中。（临用前配制）

2. 蔗糖溶液（1%）

3. 3,5-二硝基水杨酸 试剂 （DNS试剂）

将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备用。

4. 磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH6.8）

5. NaOH溶液（6mol/L）

6. NaCl溶液（0.3%）

五. 操作步骤

1. 唾液淀粉酶的制备

(1) 提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。

(2) 过滤：将口腔中的酶提取液用一层脱脂棉过滤。

(3) 稀释：取滤液1mL，用水定容至100mL。作为淀粉酶的样品液。

（由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是50～300倍，甚至超过此范围。）

2. 唾液淀粉酶的专一性实验

取4支 试管 ，按表一编号并操作，记录所观察到的颜色。

3. 唾液淀粉酶活力的测定

六. 结果处理

1. 解释表一的实验结果。

2. 根据表二的实验结果，并利用实验四“3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准曲线，计算每毫升新鲜唾液含有淀粉酶的活力单位。