原理
血清或血浆中α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1.4葡萄糖苷健水解,产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1.6糖苷键支链的糊精,在底物充分(已知浓度)的条件下,反应后加入碘液未经碘水解的淀粉结合成蓝色化合物,其颜色的深浅与未经酶促反应的空白等比较,从而推算出酶的活力单位。
材料与仪器
步骤
一、 实验试剂:
1. 0.4g/L缓冲淀粉液:于约500ml蒸馏水中溶解9克氯化钠,22.6g无水磷酸钠(或Na2HPO4·12H2O 56.94克)和 12.5g无水磷酸二氢钾,加热至沸,另取一小烧杯,精确称取0.4g可溶性淀粉,加人约10ml蒸馏水,使溶液成糊状后,加入上述沸腾之溶液中,水洗烧杯一并倒入,冷至室温后,加人37%甲醛溶液5ml,用蒸馏水稀释至1升,该溶液PH为7.0±0.1,放置冰箱保存。
2. 0.1mol/L碘贮存液:与约400ml蒸馏水中溶解1.7835g碘酸钾及22.5g碘化钾,缓慢加入4.5ml浓盐酸,边加边搅拌,用蒸馏水稀释至500ml充分混匀,贮棕色瓶塞紧置冰箱保存。
3. 0.01mol/L碘应用液:取碘贮存液,用蒸馏水稀释10倍,贮存棕色瓶置冰箱可用一个月。
二、 实验操作:血清先用生理盐水作10倍稀释,按操作进行
单位定义:100ml血清中的淀粉酶,在37℃15分钟水解5mg淀粉为一个单位。
三、计算:淀粉酶单位=(AB-AU)×/AB×800
参考值:80--180U 尿液100--1200 U
1. 0.4g/L缓冲淀粉液:于约500ml蒸馏水中溶解9克氯化钠,22.6g无水磷酸钠(或Na2HPO4·12H2O 56.94克)和 12.5g无水磷酸二氢钾,加热至沸,另取一小烧杯,精确称取0.4g可溶性淀粉,加人约10ml蒸馏水,使溶液成糊状后,加入上述沸腾之溶液中,水洗烧杯一并倒入,冷至室温后,加人37%甲醛溶液5ml,用蒸馏水稀释至1升,该溶液PH为7.0±0.1,放置冰箱保存。
2. 0.1mol/L碘贮存液:与约400ml蒸馏水中溶解1.7835g碘酸钾及22.5g碘化钾,缓慢加入4.5ml浓盐酸,边加边搅拌,用蒸馏水稀释至500ml充分混匀,贮棕色瓶塞紧置冰箱保存。
3. 0.01mol/L碘应用液:取碘贮存液,用蒸馏水稀释10倍,贮存棕色瓶置冰箱可用一个月。
二、 实验操作:血清先用生理盐水作10倍稀释,按操作进行
混匀,用660nm波长,1.0nm光径比色杯,蒸馏水调零,读取各管光密度
单位定义:100ml血清中的淀粉酶,在37℃15分钟水解5mg淀粉为一个单位。
三、计算:淀粉酶单位=(AB-AU)×/AB×800
参考值:80--180U 尿液100--1200 U
注意事项
1. 草酸盐. 枸橼酸盐,EDTA. Na2及氰化钠对AMS活性抑制,肝素无抑制。
2. 酶活性在40OU以下时,与底物的水解成线性,如测定管吸光度小于空白管吸光度一半时应将血清加大稀释倍数,或减少稀释血清加入量,测定结果,乘以稀释倍数。
3. 本法使用于其他体液淀粉酶测定,尿液先做20倍稀释后测定。
4. 唾液含高浓度淀粉绍须防止带入。
5. 淀粉溶液若出现混浊或絮状物,表示淀粉溶液受污染或变质,不能再用。
2. 酶活性在40OU以下时,与底物的水解成线性,如测定管吸光度小于空白管吸光度一半时应将血清加大稀释倍数,或减少稀释血清加入量,测定结果,乘以稀释倍数。
3. 本法使用于其他体液淀粉酶测定,尿液先做20倍稀释后测定。
4. 唾液含高浓度淀粉绍须防止带入。
5. 淀粉溶液若出现混浊或絮状物,表示淀粉溶液受污染或变质,不能再用。
来源:丁香实验