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专一性和温度、pH、激活剂及抑制剂对淀粉酶活性的影响

互联网2013-11-13

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实验原理

酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu² 还原成Cu¹ ，生成砖红色Cu₂ O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。

实验试剂

1. 1％淀粉称取淀粉1g，加少量水调成糊状，加入煮沸的0.3％NaCl溶液至100ml。

2. 1％蔗糖溶液

3. 班氏试剂 A液：取柠檬酸钠173ｇ，无水碳酸钠100ｇ，加水600ml，加热溶解，冷却后稀释至850ml；B液：取结晶硫酸铜（CuSO₄ ·5H₂ O）17.3ｇ溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。

4. 碘液：称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中，置棕色瓶内贮存备用。

5. 各种pH缓冲液

1) pH6.8缓冲液：取0.2mol/LNa₂ HPO₄ 溶液772ml，0.1mol/L柠檬酸溶液228ml混合即成。

2) pH4.0缓冲液：取0.2mol/LNa₂ HPO₄ 溶液385.5ml，0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。

3) pH8.0缓冲液：取0.2mol/LNa₂ HPO₄ 溶液972ml，0.1mol/L柠檬酸溶液28ml混合即成。6.0.9％ NaCl 溶液

6. 1％CuSO₄ 溶液

7. 1％Na₂ SO₄ 溶液

实验设备

1. 滴管、烧杯、试管（架）及试管夹。

2. 恒温水浴箱与水浴锅。

3. 脱脂棉、漏斗及纱布。

4. 白瓷反应盘。

实验材料

待测淀粉酶

实验步骤

1. 唾液淀粉酶的收集与处理

1) 制备唾液
实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。
2) 煮沸唾液
取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。
3) 稀释唾液
调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：
a. 第1排每凹各加1滴制备唾液，1₂ 、1₃ 、1₄ 凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（1₄ →1₂ ）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。
b. 在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用a混匀法充分混匀，置37℃下5min。
c. 在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。

2. 唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察

1) 取试管3支编号，按下表1操作

表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察

试剂试管	pH6.8缓冲液	1％淀粉溶液	1％蔗糖溶液	制备唾液	煮沸唾液
1	20滴	10滴	－	5滴	－
2	20滴	10滴	－	－	5滴
3	20滴	－	10滴	5滴	－

将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，再放入沸水浴中煮沸约15分钟，观察各管颜色反应，并说明原因。

2) 温度影响酶促反应的实验观察

a. 取试管3支编号，按下表2操作：

表2 温度影响酶促反应的实验观察

管号试剂	1	2	3
1.pH6.8缓冲液	20滴	20滴	20滴
2.1％淀粉溶液	10滴	10滴	10滴
3.预热5min	37℃水浴	沸水浴	冰浴
4.直接加入稀释唾液，立即混匀、计时	5滴	5滴	5滴
5.保温10min	37℃水浴	沸水浴	冰浴

b. 将一、二管移入冰水浴中，待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明温度对酶促反应的影响。

3) pH影响酶促反应的实验观察

a. 取试管3支编号，按下表3操作：

表3 pH影响酶促反应的实验观察

	pH4.0缓冲液	pH6.8缓冲液	pH8.0缓冲液	1％淀粉溶液	稀释唾液
试管1	20滴	－	－	10滴	5滴
试管2	－	20滴	－	10滴	5滴
试管3	－	－	20滴	10滴	5滴

b. 将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明pH对酶促反应的影响。

4) 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察

a. 取试管4支编号，按下操作：

表4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察

	pH 6.8 缓冲液	1％淀粉溶液	蒸馏水	0.9％NaCl	1％ CuSO₄	1％Na₂ SO₄	稀释唾液
1	20滴	10滴	10滴	－	－	－	5滴
2	20滴	10滴	－	10滴	－	－	5滴
3	20滴	10滴	－	－	10滴	－	5滴
4	20滴	10滴	－	－	－	10滴	5滴

b. 将上述各管放入37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观各管颜色的区别，并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。

注意事项

1. 反应试管应清洗干净，不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用；

2. 使用混合唾液，或通过预试选出合适的唾液稀释度，效果更为显著。

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为什么在测定α-淀粉酶活性的时候，取试管4支，要注明两支为测定管呢

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