我的BSP测DNA甲基化经验

最近因为发现一个gene在多种肿瘤中被silenced, 我也在做DNA甲基化. 这里把我折腾1个月的经验和大家分享

1. Genomic DNA extraction

这一步其实也很重要,尤其是对tissue来说. 大家知道DNA hypermethylation会导致chromatin结构紧密, 所以这一步尽量去除DNA结合的蛋白很重要. 我们实验室常用Qiagen的两个kits效果都不是太好,最后还是用proteinase K处理后酚提醇沉效果最好, 产率高纯度好.

2. bisulfite conversion

我试过zymo research的methylation gold和Qiagen的epitech kit, 结果都不work. 当时很打击我对各种kit的信心啊! 自己买试剂按文献上的方法做, 结果还是不好. 自己再琢磨, 这段DNA GC% 高, CpG很多(more than 200 within ~2000bp), 再看文献(尤其是近两年的, 有不少改进), 最后把bisulfite浓度和incubation time都加大, 然后就出来了. 然后再用kit的试剂, 多run两个变性-转化的循环, 结果也不错.

在BSP中genomic DNA的大小完整并不重要. 为了变性完全,可以先用内切酶消化DNA过夜(必须选用在你的目的序列上没有切点的)再酚提醇沉. 或者,把DNA溶液通过注射器针头(26~27G)几次以打断DNA.

检测转化是否完全,我是用正常的primers和BSP primers做PCR, 全是BSP产物没有正常PCR产物我就认为基本完全了.

3. BSP

这一步还好,只要primer设计好了. PCR产物最好不要超过300bp否则比较难. 另外,推荐一个网站: bisearch.enzim.hu, BSP相关primer design, 挺好, 最重要的是你可以search whole genome (human, mice, etc.)来确认非特异的结合和产物, 因为大部分C都转化成T之后, 非特异的可能性大大增加. (此处非广告)

还有, touch down PCR对BSP很好用(对所有有false priming问题的PCR应该都有用), 我一般从TA高几度开始,到低5度结束, 效果很好.

4. sequencin

我是把PCR产物装到invitrogen的TA vector里再送去测序(PCR必须用Taq). 室温连接5分钟, 然后转化. Kit里面建议的用量可以减半.

OK, good luck to everybody!