DNA酶解及DNA片段琼脂糖凝胶电泳

【目的要求】

1.掌握限制性核酸内切酶概念、特点及作用原理，DNA酶解技术的应用

2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段原理及其操作

3.熟悉电泳基本原理及其影响因素

【教学内容】

1．限制性核酸内切酶概念、特点及作用原理，DNA酶解技术的应用

2．DNA片段琼脂糖凝胶电泳

3．电泳概念、分类、应用、基本原理及其影响因素，琼脂糖凝胶制备、加样、电泳及结果分析

【实验】

一．DNA酶解

原理：

1.限制性核酸内切酶：是一类能识别并水解双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。一般能识别4-6个碱基对，并在特定位点切割。如：HindⅢ A↓A G C T T

EcoRⅠ G↓A A T T C

HpuⅡ C↓C G G

2.酶单位数：在最适温度、PH条件下，1小时完全水解1μgλDNA所需的酶量为1个单位。

试剂：

(1)λDNA（0.38μg/μl）

(2)HindⅢ (16u/μl)

(3)酶解Buffer(Tris-HCl,NaCl,MgCl2,DTT )

(4)反应终止液（溴酚蓝1%，SDS 1%，EDTA 2%，甘油50%）

方法：1.取两只EP管充分混匀

（1）λDNA 10μl，双蒸水 10μl

（2）λDNA 10μl，HindⅢ 10μl

2.37℃水浴2小时。

3.保温结束后加入终止液5μl。

二.琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（水平潜水式）

原理：

1． DNA含有PO43-基团，在pH7.5 Buffer中带负电,在电场中向正极移动。由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，自由电泳时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开

2． 选用适当浓度的凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应（凝胶孔径对大小不同的分子有不同的阻力），使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的，同样条件对Maker电泳，对比观察DNA酶解效果

3． DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。标准Maker经溴乙锭（EB）染色可以观察到6条带，分别为: 23Kb,9.9Kb,4.4Kb,4.3Kb,2.2Kb,2.0Kb

试剂：（1）1%琼脂糖（2）TAE液（3）Marker（4）EB

方法：

1.电泳仪接线：黑（负）—黑，红（正）—红

2．凝胶槽准备：用胶布固定胶槽两侧，调整梳子高度距离槽底2-3毫米，调好水平。

3．灌胶：

(1)称取0.8克琼脂糖,加入80毫升TAE中,热浴溶解至透明

(2)60℃左右加入EB100μl(终浓度0.5μg/ml),倒入备好的凝胶槽中。应注意胶面平整,无气泡

(3)冷却后,拔去梳子

4．加样:

(1)去掉胶布，将灌好的胶板平放在电泳槽中

(2)加入电极Buffer使之高出胶面(1-3毫米)

(3)用进样器吸样品20μl加入样品槽中

5．电泳: v = 100V,1-1.5小时,至溴酚蓝移出2/3

6．观察: (戴手套)紫外灯下（254-365nm）,暗处观察,记录。可见DNA橙红色区带

【注意事项】

1．在EP管加入试剂时要用漩涡混合器混合后离心。

2．琼脂糖凝胶电泳时加样侧应位于负极端。

3．溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护。

4．紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。