DNA片段的琼脂糖凝胶电泳
互联网
1728
- 相关专题
琼脂 糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。
【操作步骤】
1、将凝胶成形模具两端用医用胶布封好，水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间。
2、称取DNA电泳用琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧杯中，加入100ml 1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。
3、关闭电炉，取下三角烧瓶，将其置室温下冷却至70℃左右（手握烧瓶可以耐受），再加入溴化乙锭（10mg/ml）5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml。
4、室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，揭去二端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽 中。
5、在电泳槽中加入1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。
6、取EP管三支，标号，如下表所示准备电泳样品。
1
2
3
样品
λDNA/HindⅢ
未酶解质粒
酶解质粒
10μl（lr）
10μl（~2r）
10μl（~2r）
6×点样液
2μl
2μl
2μl
7、将上面三管样品置震荡器上混匀，短暂离心。8、用加样器吸取样品。依次分别加入三个点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。
9、接通电源，调节电压至50伏，电泳90分钟后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。
注：1、细菌噬菌体DNA全长49.01kb，其序列及酶切位点已研究清楚，它经不同的限制性内切酶消化后可产生不同的电泳带图谱。因为每条区带的DNA长度是已知的，所以被选为基因工程中常用的DNA分子大小标准，与其进行比较计算，即可得到待测DNA片段的长度，λDNA经HindⅢ消化后产生7条区带，依次为23.7；9.46；6.75；4.26；2.26；1.98；0.58(kb)。
2、溴化乙锭为一种有毒试剂，使用时一定要戴手套操作，注意防护。
【仪器与器材】
1、电泳仪
2、水平式核酸电泳槽
3、紫外灯
【试剂与材料】
1、琼脂糖
2、6×点样缓冲渡：0.25%溴酚兰、40%蔗糖
3、DNA分子量标准：λDNA分子量标准：λDNA/HindⅢ
4、50×TAE电泳缓冲液贮存液配方：（50×）每升
242g Tris
57.1ml 冰醋酸
100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
1×缓冲液浓度：0.04mol/L Tris HAc、0.002mol/L EDTA
5、0.8%琼脂糖：0.8g琼脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解
6、10mg/ml EB 1.0g 溴乙锭
100ml 三蒸水
【附 注】
影响DAN片段琼脂糖电泳的几个因素：
1、DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子 量的对数值成反比。
2、琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶浓度
可分辨的线性DNA片段大小（kb）
0.4
5~60
0.7
0.8~10
1.0
0.4~6
1.5
0.2~4
1.75
0.2~3
2.0
0.1~3
琼脂糖凝胶浓度
可分辨的线性DNA片段大小（kb）
3、DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。4、电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。
