免疫学方法（ELISA法）检测细胞凋亡

细胞凋亡事件发生时，会出现蛋白质和核酸分子结构的改变，形成新的表位。利用免疫学方法对这些表位进行鉴定，有助于判断样本中细胞凋亡事件的发生。

细胞凋亡的发生，是由于内源性核酸内切酶的激活，这种钙和镁依赖性核酸酶容易进入的核小体间区解开双链DNA，产生单/低聚核小体片段，而核小体本身由于DNA与组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶裂解。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的单/低聚核小体，从而判断细胞是否发生凋亡。

[材料与试剂]

(1)生物素标记的小鼠抗-组蛋白单克隆抗体；

(2)过氧化物酶(-POD)标记的小鼠抗DNA单克隆抗体；

(3)链霉亲合素包被的微孔板；

(4)DNA-组蛋白复合物，作为阳性对照；

(5)ABTS底物；

(6)溶解缓冲液；

(7)温育缓冲液；

(8)底物缓冲液；

(9)培养细胞或离体细胞的裂解物(细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200μl溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min)；

(10)培养细胞的上清液；

(11)血浆(血清)；

(12)分光光度计

[操作步骤]

(1)取样品离心后(1000r/min，10min)，吸取20μl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中；

(2)另加入80μl免疫反应试剂：含抗-DNA-POD、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液(按1:1:18混合)，室温下孵育2h(置摇床上，250r/min)；

(3)弃上清，用300μl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液；

(4)加入100μl底物缓冲液，室温下孵育至颜色变化至适合(置平板摇床上)；

[结果判断]

尽快作比色分析(10～20min内)，用底物缓冲液作空白对照，检测波长405nm，参考波长492nm。

聚集值=样品的mU(诱导凋亡处理的细胞)/对照的mU(未经诱导凋亡处理的细胞)100~Kbr_~H~M_______注：mU=吸收值(10-3 )=双孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若样品的吸收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。