【共享】细胞凋亡免疫学检测方法
丁香园
1992
细胞凋亡免疫学检测方法
原理：早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是创新提出的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）。
其特征为：整个胞体成浓缩状态，有特异性胞浆大泡，细胞质，核质深染，核碎裂后被细胞膜包裹而形成凋亡小体。它有别于细胞死亡。在琼脂糖凝胶点涌上显示特殊的DNA梯状图谱。它的出现主要是由于一种钙-镁依赖性核算内切酶激活后，裂解染色质核小体之间的链接DNA，将核小体切割成180bp--200bp或其倍数的片段所致。Apo是不可逆的过程，散在分布于组织中，形成的凋亡小体，除核裂解外，外有膜包绕，内有完整的细胞器凋亡小体在组织中很快被临近组织细胞吞噬，并在溶酶体中被降解。因此，Apo不引起周围组织炎症及损伤。Apo是集体自己启动，由细胞本身主动控制，由基因知道的细胞自我消亡过程。因此，又称程序性死亡。
光镜下，Apo典型形态学特征是核染色质广泛凝聚，细胞体积缩小，胞质浓缩，有凋亡小体存在，细胞表面特化结构如微绒毛等丢失及细胞表面明显迂曲。体内凋亡过程发展非常迅速，细胞常在数小时内完成Apo并讲解，凋亡细胞仅出现数分钟就消失，故不易应用形态学方法（普通光学显微镜检测法，荧光显微镜检测法，凋亡小体的点经观察及凋亡指数和细胞活力的定量侧死那个）来检测。在生物化学方面，利用电泳技术证明核体断片的“DNA梯状图谱”作为检测群体细胞发生凋亡的一个指标。经过人们多年的研究发现，应用原位末端转移酶标记技术（TDT assay or TUNEL reaction）来检测细胞凋亡，其令名都高，特异性强，能早期显示未发生典型变化的凋亡细胞。他是检测单个细胞早期出现凋亡现象的好方法。近年来，人们又发现了能更快，更敏感，检测细胞数量更多的并能从更多方面证明凋亡和坏死的流逝细胞分析术等。
1 （ELISA法）检测细胞凋亡
细胞凋亡事件发生时，会出现蛋白质和核酸分子结构的改变，形成新的表位。利用免疫学方法对这些表位进行鉴定，有助于判断样本中细胞凋亡事件的发生。
细胞凋亡的发生，是由于内源性核酸内切酶的激活，这种钙和镁依赖性核酸酶容易进入的核小体间区解开双链DNA，产生单/低聚核小体片段，而核小体本身由于DNA与组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶裂解。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的单/低聚核小体，从而判断细胞是否发生凋亡。
【材料与试剂】
（1） 生物素标记的小鼠抗-组蛋白单克隆抗体；
（2） 过氧化物酶（-POD）标记的小鼠抗DNA单克隆抗体；
（3） 链霉亲合素包被的微孔板；
（4） DNA-组蛋白复合物，作为阳性对照；
（5） ABTS底物；
（6） 溶解缓冲液；
（7） 温育缓冲液；
底物缓冲液；
培养细胞或离体细胞的裂解物（细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200μl溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min）；
培养细胞的上清液；
血浆（血清）；
分光光度计
【操作步骤】
（1） 取样品离心后（1000r/min， 10min），吸取20μl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中；
（2） 另加入80μl免疫反应试剂：含抗-DNA-POD、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液（按1:1:18混合），室温下孵育2h（置摇床上，250r/min）；
（3） 弃上清，用300μl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液；
（4） 加入100μl底物缓冲液，室温下孵育至颜色变化至适合（置平板摇床上）；
【结果判断】
尽快作比色分析（10～20min内），用底物缓冲液作空白对照，检测波长405nm，参考波长492nm。
聚集值 = 样品的mU（诱导凋亡处理的细胞） × 100
对照的mU（未经诱导凋亡处理的细胞）
注：mU=吸收值（10-3）=双孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若样品的吸收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。
2原位末端转移酶标记技术
（一）原理
凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA切割成许多双链DNA片段及高分子量单恋断裂点（缺口），暴露大量3-羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）将标记的dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标法。
（二）荧光标记法
1.材料与试剂 采用德国Boehriner-Mannheim公司in Situ cell death detection试剂盒，包括：
（1）生物素标记的-dutp（biotin-dutp）或地高辛标记的-dutp(digoxingningll-dutp)1 nmol/ul
(2)tdt酶（25u/ul）
(3)反应缓冲液
（4）洗涤缓冲液
（5）异硫氰酸荧光素（fitc）标记的℃亲和素或链酶亲和素（2.5ug/ml）或地高辛抗体（1：30）
（6）Pi染液（含PI5ug/ul及DNA酶活性的RNA酶0.1%）
(7)PBS缓冲液
(8)塑料盖玻片
2.样品
（1）悬浮生长培养细胞的甩片或涂片
（2）贴壁生长的培养细胞
（3）冰冻切片
（4）常规石蜡切片
3.操作方法
（1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min（4℃）后，泳0%究竟再固定2h（-20℃）.常规4%中性福尔马林固定，石蜡包埋之切片进行拖拉、水化
（2）洗涤：拨片进入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min三次
（3）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50ul/cm2滴加反应液（每50ul反应液含TDT酶0.5ul标记的-dtup1ul），使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h。
（4）终止反应：去掉盖玻片，将玻片置盛有缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5分钟
（5）FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50ul/cm2滴加FITC反应液(含FITC2.5ug/ul)
（6）洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5分钟
（7）PI复染：将玻片置盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30分钟
（8）封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察
4结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激光发光（波长480），所有的细胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异的标记上FITC，显示出绿色荧光。
（三）酶标法
1.材料与试剂 采用美国Oncor Apop TagTm-Peroxidase试剂盒，包括：
（1）过氧化物酶标记的地高辛标记(2)tdt酶（25u/ul）
(3)反应缓冲液
（4）反应终止/洗涤缓冲液
（5）蛋白酶K消化液：20ul/ml蛋白酶K溶于PBS
（6）Tdt酶
(7)平衡缓冲液
(8)塑料盖玻片及玻璃盖玻片
（9）30%H2O2
（10）甲基绿染液：0.5%甲基绿溶于0.1Mol/L枸醛酸钠，ph调整值4.0
2.样品：同荧光素标记法
3.操作方法：
1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min（4℃）后，泳0%究竟再固定2h（-20℃）.常规4%中性福尔马林固定，石蜡包埋之切片进行拖拉、水化
（2）内源性过氧化物封闭 玻片置于盛有0.5%H2O2缓冲液的染色缸，室温下作用20min，同荧光素标记法洗涤。
（3）消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室温下消化15分钟，洗涤同上。
（4）平衡处理：用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，滴加平衡缓冲液（70ul/cm2）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5-10分钟
（5）反应：移去盖玻片倒掉平衡液，用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50ul/cm2滴加反应液（每50ul反应液含18ulTDT酶+36ul反应缓冲液），使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h。
（6）终止反应：去掉盖玻片，将玻片置盛有终止/洗涤液的染色缸内，37°下洗涤30分钟（置摇床上），然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5分钟。
（7）地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，滴加70UL过氧化物酶标记的地高辛抗体均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育30分
（8）洗涤：至于洗涤缓冲液中洗两次每次5分钟
（9）用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，滴加新鲜配制的DAB显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用3-6分钟
（10）置于蒸馏水中洗涤3次，每次3-6分钟
（11）套染：将玻片置于吃呢共有甲基绿染液的染色缸中室温染色10风中
（12）洗涤：蒸馏水洗涤3次（至于摇床上），每次2分钟
（13）脱水、风片：100%正丁醇，3次，2分每次二甲苯，3次，2分每次，明胶甘油封片。
4结果判定：用荧光显微镜观察，所有的细胞核均被着色，显示出绿色，而凋亡细胞被特异的标记上FITC，显示出棕黄色。
原理：早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是创新提出的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）。
其特征为：整个胞体成浓缩状态，有特异性胞浆大泡，细胞质，核质深染，核碎裂后被细胞膜包裹而形成凋亡小体。它有别于细胞死亡。在琼脂糖凝胶点涌上显示特殊的DNA梯状图谱。它的出现主要是由于一种钙-镁依赖性核算内切酶激活后，裂解染色质核小体之间的链接DNA，将核小体切割成180bp--200bp或其倍数的片段所致。Apo是不可逆的过程，散在分布于组织中，形成的凋亡小体，除核裂解外，外有膜包绕，内有完整的细胞器凋亡小体在组织中很快被临近组织细胞吞噬，并在溶酶体中被降解。因此，Apo不引起周围组织炎症及损伤。Apo是集体自己启动，由细胞本身主动控制，由基因知道的细胞自我消亡过程。因此，又称程序性死亡。
光镜下，Apo典型形态学特征是核染色质广泛凝聚，细胞体积缩小，胞质浓缩，有凋亡小体存在，细胞表面特化结构如微绒毛等丢失及细胞表面明显迂曲。体内凋亡过程发展非常迅速，细胞常在数小时内完成Apo并讲解，凋亡细胞仅出现数分钟就消失，故不易应用形态学方法（普通光学显微镜检测法，荧光显微镜检测法，凋亡小体的点经观察及凋亡指数和细胞活力的定量侧死那个）来检测。在生物化学方面，利用电泳技术证明核体断片的“DNA梯状图谱”作为检测群体细胞发生凋亡的一个指标。经过人们多年的研究发现，应用原位末端转移酶标记技术（TDT assay or TUNEL reaction）来检测细胞凋亡，其令名都高，特异性强，能早期显示未发生典型变化的凋亡细胞。他是检测单个细胞早期出现凋亡现象的好方法。近年来，人们又发现了能更快，更敏感，检测细胞数量更多的并能从更多方面证明凋亡和坏死的流逝细胞分析术等。
1 （ELISA法）检测细胞凋亡
细胞凋亡事件发生时，会出现蛋白质和核酸分子结构的改变，形成新的表位。利用免疫学方法对这些表位进行鉴定，有助于判断样本中细胞凋亡事件的发生。
细胞凋亡的发生，是由于内源性核酸内切酶的激活，这种钙和镁依赖性核酸酶容易进入的核小体间区解开双链DNA，产生单/低聚核小体片段，而核小体本身由于DNA与组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶裂解。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的单/低聚核小体，从而判断细胞是否发生凋亡。
【材料与试剂】
（1） 生物素标记的小鼠抗-组蛋白单克隆抗体；
（2） 过氧化物酶（-POD）标记的小鼠抗DNA单克隆抗体；
（3） 链霉亲合素包被的微孔板；
（4） DNA-组蛋白复合物，作为阳性对照；
（5） ABTS底物；
（6） 溶解缓冲液；
（7） 温育缓冲液；
底物缓冲液；
培养细胞或离体细胞的裂解物（细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200μl溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min）；
培养细胞的上清液；
血浆（血清）；
分光光度计
【操作步骤】
（1） 取样品离心后（1000r/min， 10min），吸取20μl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中；
（2） 另加入80μl免疫反应试剂：含抗-DNA-POD、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液（按1:1:18混合），室温下孵育2h（置摇床上，250r/min）；
（3） 弃上清，用300μl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液；
（4） 加入100μl底物缓冲液，室温下孵育至颜色变化至适合（置平板摇床上）；
【结果判断】
尽快作比色分析（10～20min内），用底物缓冲液作空白对照，检测波长405nm，参考波长492nm。
聚集值 = 样品的mU（诱导凋亡处理的细胞） × 100
对照的mU（未经诱导凋亡处理的细胞）
注：mU=吸收值（10-3）=双孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若样品的吸收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。
2原位末端转移酶标记技术
（一）原理
凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA切割成许多双链DNA片段及高分子量单恋断裂点（缺口），暴露大量3-羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）将标记的dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标法。
（二）荧光标记法
1.材料与试剂 采用德国Boehriner-Mannheim公司in Situ cell death detection试剂盒，包括：
（1）生物素标记的-dutp（biotin-dutp）或地高辛标记的-dutp(digoxingningll-dutp)1 nmol/ul
(2)tdt酶（25u/ul）
(3)反应缓冲液
（4）洗涤缓冲液
（5）异硫氰酸荧光素（fitc）标记的℃亲和素或链酶亲和素（2.5ug/ml）或地高辛抗体（1：30）
（6）Pi染液（含PI5ug/ul及DNA酶活性的RNA酶0.1%）
(7)PBS缓冲液
(8)塑料盖玻片
2.样品
（1）悬浮生长培养细胞的甩片或涂片
（2）贴壁生长的培养细胞
（3）冰冻切片
（4）常规石蜡切片
3.操作方法
（1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min（4℃）后，泳0%究竟再固定2h（-20℃）.常规4%中性福尔马林固定，石蜡包埋之切片进行拖拉、水化
（2）洗涤：拨片进入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min三次
（3）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50ul/cm2滴加反应液（每50ul反应液含TDT酶0.5ul标记的-dtup1ul），使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h。
（4）终止反应：去掉盖玻片，将玻片置盛有缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5分钟
（5）FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50ul/cm2滴加FITC反应液(含FITC2.5ug/ul)
（6）洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5分钟
（7）PI复染：将玻片置盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30分钟
（8）封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察
4结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激光发光（波长480），所有的细胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异的标记上FITC，显示出绿色荧光。
（三）酶标法
1.材料与试剂 采用美国Oncor Apop TagTm-Peroxidase试剂盒，包括：
（1）过氧化物酶标记的地高辛标记(2)tdt酶（25u/ul）
(3)反应缓冲液
（4）反应终止/洗涤缓冲液
（5）蛋白酶K消化液：20ul/ml蛋白酶K溶于PBS
（6）Tdt酶
(7)平衡缓冲液
(8)塑料盖玻片及玻璃盖玻片
（9）30%H2O2
（10）甲基绿染液：0.5%甲基绿溶于0.1Mol/L枸醛酸钠，ph调整值4.0
2.样品：同荧光素标记法
3.操作方法：
1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min（4℃）后，泳0%究竟再固定2h（-20℃）.常规4%中性福尔马林固定，石蜡包埋之切片进行拖拉、水化
（2）内源性过氧化物封闭 玻片置于盛有0.5%H2O2缓冲液的染色缸，室温下作用20min，同荧光素标记法洗涤。
（3）消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室温下消化15分钟，洗涤同上。
（4）平衡处理：用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，滴加平衡缓冲液（70ul/cm2）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5-10分钟
（5）反应：移去盖玻片倒掉平衡液，用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50ul/cm2滴加反应液（每50ul反应液含18ulTDT酶+36ul反应缓冲液），使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h。
（6）终止反应：去掉盖玻片，将玻片置盛有终止/洗涤液的染色缸内，37°下洗涤30分钟（置摇床上），然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5分钟。
（7）地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，滴加70UL过氧化物酶标记的地高辛抗体均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育30分
（8）洗涤：至于洗涤缓冲液中洗两次每次5分钟
（9）用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，滴加新鲜配制的DAB显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用3-6分钟
（10）置于蒸馏水中洗涤3次，每次3-6分钟
（11）套染：将玻片置于吃呢共有甲基绿染液的染色缸中室温染色10风中
（12）洗涤：蒸馏水洗涤3次（至于摇床上），每次2分钟
（13）脱水、风片：100%正丁醇，3次，2分每次二甲苯，3次，2分每次，明胶甘油封片。
4结果判定：用荧光显微镜观察，所有的细胞核均被着色，显示出绿色，而凋亡细胞被特异的标记上FITC，显示出棕黄色。
