质粒 DNA 琼脂糖凝胶电泳定量及定量检测

[ 实验目的 ]

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术。

[ 实验原理 ]

DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖 - 磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极移动。

在一定的电场强度下， DAN 的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的 DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。不同构型的 DNA 分子迁移率不同。 凝胶中的 DNA 可与荧光染料溴化乙锭 (EB) 结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。

[ 仪器、材料与试剂 ]

（一）仪器

1. 水平电泳槽

2 ．电泳仪

3 ．紫外灯或凝胶成像仪

（二）材料

1. 冰醋酸

2. 三羟甲基氨基甲烷（ Tris ）

3. 乙二胺四乙酸（ EDTA ）

4. 溴酚兰

5. 琼脂糖

7. 甘油

8. DNA 染料

9. 吸头、小离心管

（三）试剂

6×DNA 电泳加样缓冲液：

甘油 30%

溴酚蓝 0. 25%

Tris-Cl(pH8. 0) 70%

4℃ 保存。 室温保存，用时稀释 5 倍。

DNA 分子量标准： 200bp Ladder

λDNA 分子量标准： 5ng/ul ， 10ng/ul

50×TAE 电泳缓冲液贮存液配方： (50×) 每升

242g Tris

57. 1ml 冰醋酸

100ml 0. 5mol/L EDTA(pH8. 0)

　　　　　室温保存，用时稀释 50 倍。

10mg/ml EB ： 1. 0g 溴乙锭溶于 100ml 超纯水中。

[ 实验步骤 ]

（一）制备琼脂糖凝胶

1 ．称 1. 2g 琼脂糖，加 100ml 电泳缓冲液（ 1×TAE ）加热熔化，取出摇匀，即为 1. 2% 的凝胶。

2. 当胶液冷至 60℃ 时，加 EB10μl ，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。

3 ．待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于电泳槽中，加入 1×TAE ，让液面高于胶面 2 -3mm 。

4 ．取 4ul 质粒，加 2ul lodaing buffer ， 6ulddH 2 O ，混匀，用加样器吸取样品。加入点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。

5 ．接通电源， 1-5V/cm 电压，开始电泳。

6 ．当溴酚兰染料移动到距离胶前沿 1 -2cm 处，停止电泳。

7. 切断电源后，取出凝胶，在紫外灯（ 360nm 、 312nm 或 254nm ）下或经凝胶成像系统观察或拍照。

附注：

影响 DNA 片段琼脂糖电泳的几个因素：

1. DNA 分子的大小：线性 DNA 分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。

2. 琼脂糖浓度：一定大小的 DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的 DNA 片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的 DNA ，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。



3. DNA 分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋 DNA 分子迁移率比线性 DNA 分子快，线性 DNA 分子比开环 DNA 分子快。

4. 电流强度：每厘米凝胶电压不超过 5V ，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性 DNA 分子的电泳迁移率与所用电压成正比。